Kay和Wong,（1986)将急性分离细胞法应用于成熟神经元特性的研究。根据形态学和神经化学特点，一般认为大鼠神经元在出生5周左右即发育成熟(Miller,1988)。最初，建立急性分离法的目的是为了研究成熟神经元膜通道及离子泵的生物物理特性。研究者希望通过该法得到的细胞在通道特性方面与其他更加完整的细胞制备法（如脑片等）相比并无明显差异。
急性分离法具有简单易行及成本低廉的特点，因此相比组织培养等细胞制备法来讲，在某些研究中急性分离法更具有吸引力。急性分离法保留了细胞的超微结构，但与此同时，立体的突出小结也有可能残于胞体或突起上等(Kay andWong, 1986)，这些突触结在某些情况下会释放出神经递质(Drewe et al., 1988).急性分离法同样可以适用于小鼠及人类的神经元制备Alonso et al., 1993)，由此推测此法同样适用于其他的哺乳动物种系。然而此法不适用于研究具有具体时象特点的细胞事件，因为细胞在分离过程中肯定发生损伤，在没有支持物质的情况下，只能存活一至两个小时。
酶的选择
急性分离法中酶的应用基于大量商品酶的生产和广泛使用(White et al., 1993)，建立高效的急性分离法的步骤如下。起初，人们用商业用酶观察其是否能使大鼠的新皮层脑片崩解（无酶的溶液不能产生可辨认的神经元），据此确定了有效酶的种类，随后又通过实验确定了这些酶的最适浓度和最佳消化时间，并围绕有效酶做了一系列消化实验。在急性分离时短时使用非特异性的蛋白酶的原理是为了清除细胞外的基质，随后发现很多特异性的蛋白酶在促使细胞从基质包绕中释放的同时并不带有细胞内在特性的损伤。在对每个种类的酶进行了一系列电生理检测后，发现做为评价神经元状态的指标，电生理指标优于神经元的形态学指标及活性染料摄取指标。
使用蛋白激酶K（5分种消化）本身并不能使神经元释放，但是与随后加入的胰酶配伍，可以使急性分离的细胞质量大大增加。我们推测胰酶可能消化残存的蛋白酶K，因为过量的蛋白酶K会损伤细胞。番木瓜蛋白酶同胰酶一样，在消化过程的第二阶段发挥作用，但是经其消化得到的细胞电生理特性有时较差。值得指出，在短暂的蛋白酶K消化后进行长时间胰酶消化，得到的高质量神经元的数量远远大于两种酶单独使用。
使用其他的高效酶，如链霉蛋白酶、锯齿肽酶、枯草杆菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶等，均可得到形态完好的神经元，这些神经元具有很长的突起，相差明亮，醋酸荧光素摄取能力强。这些细胞在进行膜片钳操作时极易形成吉欧姆封接，但是很难形成全细胞记录，因为这些神经元的输入阻抗教低而且容易迅速崩解。
我们尝试通过一系列的保护性措施提高急性分离神经元的质量和产量，然而通过研究发现以下手段并不能达到优化的目的：1，消化结束后在组织孵育液中加入胰酶抑制剂；2，在蔗糖溶液中分离脑片(Aghajanian and Rasmussen, 1989)；3.改通纯氧为50％O2＋50％N2的混合气体；4.加入50μM APV和0.5mM犬尿烯酸，5.消化前将脑片孵育于重碳酸盐溶液。
吹打细胞时在PIPES液中加入0.5mg/mlBSA可以提高神经元的质量。当操作全程使用BSA时，在动物断头的前两小时不影响神经元的 产量，而两小时以后使用BSA会使神经元的产量有所降低。我们还发现，急性分离制备神经元的过程中向PIPES液中加入稀释50倍的无血清支持物B27, (Life Technologies; Brewer et al., 1993)，可以提高神经元的质量和产量。
用蛋白水解酶消化哺乳动物脑片时也存在一些很不利的因素，比如有时细胞受体对某些酶相当敏感。NMDA受体对蛋白水解作用相当敏感(Akaike et al., 1988; Allen et al., 1988)，这种不利效应可以通过限制酶的剂量和缩短消化时间等手段来部分克服。超极化激活的混合阳离子电流也对蛋白水解作用非常敏感(Budde et al., 1994)，至今尚未发现任何酶能够不引起这种效应。我们尝试能否通过无酶的方式分离到成熟大鼠的新皮层神经元，但是没有成功，我们发现以下的方法是无效的：1.完全的机械分离，如研磨或水喷；2.使用无钙环境和二价离子螯合剂；3.建立高渗或低渗环境；4.利用高浓度的单糖溶液及强力粘着分子RGD(Ruoslahti and Pierschbacher, 1987)干扰糖蛋白之间的相互联系；5，工作液中加入3μM氟代柠檬酸扰乱胶质细胞代谢(Paulsen et al., 1987).
此外，我们尝试是否能够利用非蛋白水解酶分离神经元，但是未能成功，我们使用过的酶如下：1. (1) 0.07 U/ml 软骨素酶, 1.3 U/ml 透明质酸酶以及0.002 U/ml 类肝素酶的混合溶液；2. 内切糖苷酶混合液：1666 U/ml 内切糖苷酶 H和 1333 U/ml肽: N-糖苷酶F(both from New England Biolabs).
此法中酶的使用完全是凭经验建立的，关于酶如何影响成熟个体中枢神经系统神经元内分子间的相互关系尚不清楚。如果阐明了这些机制，可能有利于我们建立一整套更加有效的针对成熟神经元的急性分离方法。
关键问题
急性分离中最重要环节是快速取脑，而且动作必需十分轻柔。从动物断头取脑到切出的脑片孵育于饱和氧气的液体中的时间必需尽量缩短，经过练习，这段时间可以控制在5分种内。另外一个非常重要的环节是实验操作中手法一定要轻柔，避免对组织直接施压和挤压。
急性分离法最初应用于分离豚鼠大脑神经元，此时利用PIPES液的效果优于使用HEPES液(Kay and Wong, 1986)。我们没有重复这个实验，但是我们发现分离豚鼠神经元时使用重碳酸盐溶液可以导致神经元产量的减少，而稍微偏低的PH值（微低于正常的7.0）可以增加细胞产量。
急性分离神经元时，细胞的产量具有很大的脑区差异性。有些脑区非常容易受损，有些脑区对缺氧非常敏感，同各个脑区之间细胞外基质的构成差异很大。例如，嗅球的结构非常的精巧，这就决定了在分离嗅球细胞时，可以不使用蛋白酶K，而只需在室温下利用0.7mg/ml的胰酶消化30分种即可。此外，细胞的产量与动物的年龄成负相关。
问题排查
分离出神经元的质量可以在相差、hoffman或者数字干涉差光学系统（DIC）下识别。在相差显微镜下，状态良好的细胞具有明亮的相差图像，而状态不佳的神经元则相差较暗或呈现花斑样表现。
在Hoffman系统或DIC下，状态良好的神经元具有明显的三维结构（见图6.5.2），细胞表面立体感强，并且十分光滑。状态较差的神经元的胞膜呈网状结构，有时可见胞核。状态不佳神经元的另一个明显指征是串珠样的突起。
图6.5.2 CCD（Hoffman光学系统）下急性分离的新皮层神经元图示。（A-E）状态良好的神经元；(F-G)状态差的神经元。刻度标尺＝10μm
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