急性分离法是一种简单易行的分离成熟哺乳动物中枢神经系统神经元的方法。此法最初用于单个神经元的膜片钳电生理记录，目前已广泛应用于单细胞PCR、免疫组化、荧光标记细胞的分类以及成熟神经元的长时间培养等。神经元急性分离主要涉及酶的消化和促进组织分解的离子环境。利用此法，在动物处死45分种后，就能将单个神经元从胶质细胞的包绕中分离出来。虽然急性分离的神经元丧失了完整的树突分枝，但是靠近胞体的突起仍然保留，从而能够从形态上鉴别神经元的类型。急性分离成熟的神经元的具有以下优点：1.神经元分化良好；2.细胞电致密性高，提高电压钳结果的精度；3.细胞远离对其产生影响的周围环境；4.能从成年动物的中枢神经系统中具体脑区定向分离神经元。
声明：对活体动物的所有处理均通过IACUC（Institutional Animal Care and Use Committee
，动物关怀及应用委员会）的允许，并且严格遵守正式的实验动物操作准则。
材料：
100％乙醇；PIPES盐水（配方见后）；100-300g大鼠；蛋白激酶K溶液（见后）；胰酶溶液（见后）；
组织切片机；25ml 转瓶（Bellco，有些单位称搅拌瓶）；纯氧罐及调节阀门；60mm有盖玻璃培养皿；断头剪(例如, Braintree Scientific)；14cm剪；14cm咬骨钳；有齿镊；匙状小竹板；0号黑色毛刷；解剖刀具及22号刀片；宽口巴氏吸管；磁力搅拌器(例如, Cole Parmer)
；加热箱(如Tupperware，见图Fig. 6.5.1)
图6.5.1 急性分离装置示意图。控温箱由一个塑料盒(∼14 25 5 cm, 底面清洁)和一个能够置于水中的鱼缸加热器（Hagen;thermal compact, 6 in. [15 cm], 50 W) 组成。.塑料盒上部开孔，使4个转瓶能够穿过该孔，孔的中心应开在搅拌器上板的边缘。塑料盒应该热绝缘，防止热量从磁力搅拌器发动机传向盒中；磁力搅拌器上最好安置一个2CM厚的方木板。
器材准备：
1.制备组织切片。100%乙醇消毒刀片后过水，刀片一次性使用；
2.转瓶中加入15mlPIPES液，通氧30s，随后将通气口移至液体表面，持续通氧。
3.30ml大烧杯中加入20mlPIPES液（以备取脑），60mm有盖玻璃培养皿中加入5mlPIPES液（已备孵育组织片），随后将两容器置入-20℃冰箱冻存备用。
4.将上述容器中的液体通氧30s。
断头取脑：
5.麻醉动物，待其完全镇静，用环状剪刀快速断头；
6.用拇指及食指握牢鼠头，用剪刀在上述两指间紧贴颅骨从尾端至头端平行剪开头皮；
7.用咬骨钳从枕侧轻轻刺入打开颅腔（在鼠脑尾端背面可见延伸出的颅骨），并咬出约2mm直径的小孔，顺小孔朝吻端插入剪刀，沿着中线剪开颅骨，此过程中注意剪刀必须紧贴颅骨，直到剪至嗅球，以免损伤脑组织。随后再次将剪刀插入小孔中，向左右方向呈“十”子剪开颅骨。
8.用咬骨钳咬去剪开的颅骨片（咬下的骨片应为单片），随后向皮层滴数毫升冰PIPES液。如果此时脑膜尚未剥脱，用尖端圆滑的镊子剥除脑膜
9.用末端圆滑的匙状小竹板压断脊髓。将鼠脑置于掌中，将吻侧向尾侧倾斜，随后将匙状小竹板插入鼠脑底部，小心的翘出整个鼠脑，随后置于盛有冰PIPES液的烧杯中。
制备脑片：
取未经处理的部分大脑，用组织切片机或手工切片切成约500μm的脑片，随后用湿毛刷将脑片移至盛有冰PIPES液的培养皿中。
脑片消化：
11.脑片切成2×2mm碎块，尽可能的去处白质部分，用宽口巴氏吸管移入转瓶中后，置于磁力搅拌器上轻微摇晃；
12.温箱升温至30℃后转瓶中加入100ul蛋白激酶，孵育5min。
13.除去转瓶中的盐水（保证组织块不丢失），用2-3ml新鲜PIPES漂洗。加入15mlpipes，500ul胰酶溶液，30℃孵育30分钟。以上操作中涉及的溶液均需通过约30s的氧气饱和，并且注意通氧口在溶液的表面。
14．除去转瓶中的溶液，2-3mlpipes漂洗，加入40mlpipes盐水，并使溶液温度恢复室温。
分离细胞
15.选取一块组织块置于1.5ml的微量离心管中，加入0.5ml新鲜pipes，用开口光滑的巴氏吸管（约1mm口径）吹打细胞，随后用02mm口径的吸管吹打2-4次，至大量组织团可通过吸管。（吹打过程中一定轻柔，杜绝出现气泡，没有必要完全打碎所有组织团。此外吹打过程中不要通氧，过多氧气对细胞产生毒性作用）。
16．缓慢的将上述细胞液移入培养皿（或灌流槽），待细胞贴壁后用适当的记录液（灌流液等）替换孵育用盐水。
试剂及溶液配置：
实验中涉及的所有配方中均使用Milli-Q-purified water或者等纯度的其他来源水。常规保存的母液，见附件2A （APPENDIX 2A）；试剂生产厂商，见补充附件（SUPPLIERS APPENDIX.）。
PIPES液:
6.7206 g NaCl (115 mM)
0.3733 g KCl (5 mM)
6.028 g PIPES free acid (20 mM)
1 ml 1 M CaCl2 stock solution (BDH Lab Suppliers; 1 mM final)
4 ml 1 M MgCl2 (Sigma; 4 mM final)
4.504 g D-glucose (25 mM)
H2O to 900 ml
Adjust pH to 7.0 with NaOH
Add H2O to 1 liter
Store ≤1 year at 4°C
蛋白激酶K溶液：
（此处不能很好理解，请核实：因为按照翻译后的剂量，胰酶用量太高，有悖于常规应用剂量）
每100ul CaCl2溶液（5 mM）中含3 mg蛋白激酶K（Sigma）。4℃下可以储存3周。
胰酶溶液：
每500ul不含糖的PIPES中加入15mg胰酶（Sigma, type XI）。4℃下可以储存3周。
总结
背景
虽然能够在完整的脑片（(Blanton et al., 1989; Edwards et al., 1989）或活体动物（(Ferster and Jagadeesh, 1992)上进行膜片钳操作，但是许多情况下仍须在单个细胞上进行膜片钳操作。首先，急性分离后神经元的树突干得到一定程度的修剪，从而最小化了空间膜片效应（space-clamp problem)，Spruston N, Jaffe DB, Johnston D. Dendritic attenuation of synaptic potentials and currents: the role of passive membrane properties. Trends Neurosci 1994;17(4):161-166.
进而可以在电压钳模式下更加详细的探究通道的生物物理特性(White et al., 1995).其次，通过急性分离可以使神经元免除与周围环境中其他细胞相互作用而引起的电或化学干扰；第三，急性分离方法可以实现神经元周围环境的快速转换（原句为溶液的快速转换），这在许多生物物理研究中是必需的，而在脑片实验中由于存在弥散屏障，很难达到快速转换的效果。
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