孚尔根[Feulgen]核反应染色法

一、实验目的
学习和掌握孚尔根反应染色法，鉴定植物细胞核内染色体上DNA的存在。
二、实验原理
DNA是主要的遗传物质，集中于染色体上。1924年孚尔根首先用席夫试剂(Schiff)作试验，鉴定了染色体上DNA的存在，故称为孚尔根染色法。孚尔根染色法的反应原理主要与席夫试剂的化学性质有关，此试剂的基本成分是碱性品红，偏亚硫酸氢钠(NaHSO3)和盐酸.碱性品红的主要成分是三氨基三苯甲烷氯化物。
碱性品红原为桃红色，当与亚硫酸作用时还原，使醌型变为苯型，由桃红色变为无色透明的N-亚磺酸亚硫酸副品红碱，当它与醛基作用时，其分子式又恢复为醌型结构，呈现紫红色，其反应式见图8-1。

利用1N HCl 、60℃下水解时，可将DNA分子中嘌呤碱基与去氧核糖之间的糖苷键打断，使嘌呤脱下，并使去氧核糖C-1位置释放醛基与席夫试剂反应显紫红色。细胞中只有DNA才具有这种专一的孚尔根反应，因此利用孚尔根反应，可以鉴定DNA的存在。并广泛应用于核及染色体的研究中。

图8-1 Schiff 试剂的反应过程

三、实验材料
植物根尖、减数分裂期的花药、叶片表皮、愈伤组织等。
四、实验器具和药品试剂
显微镜、恒温水浴锅、温度计、镊子、解剖针、刀片、冰箱、温箱、天平、载玻片、盖玻片、吸水纸、青霉素瓶、吸管、烧杯、量筒、切片架、切片盒、小口瓶。
95%乙醇、冰醋酸、碱性品红、偏亚硫酸氢钠、盐酸、活性炭、亮绿。
五、实验方法和步骤
（一）材料准备 取一洋葱鳞茎，置于盛满水的小烧杯上使其长出新根。待根尖长1cm 时，于上午8时剪下根尖进行预处理、固定、保存（请参考实验一）。
（二）水解 实验时，从冰箱取出预先准备好的洋葱根尖，分装到若干个青霉素瓶中，用清水洗三次，换1N HCl洗一次，倾去，换入预热60℃的1N HCl 3ml，放入恒温水浴锅中在60±0.5℃下水解10分钟（视材料而定，水解时间可以从10分钟延长至30分钟）。然后吸去热1N HCl，换入冷1N HCl洗一次，再用清水将根尖洗三次。
水解是本实验成败的关键之一。重要的是温度，应保持在60±0.5℃之间。如果温度过高或时间过长，造成水解过度，醣与醛基之间的键被破坏，醛基流失到水解液中，反之，不能出现潜在的醛基，都不能呈现颜色反应。
（三）染色 吸净水分，加入Schiff试剂避光染色30分钟，然后用漂洗液漂洗2～3次，经水洗后准备压片。
（四）压片观察 取一根尖置于载玻片上，切下生长区部位（染成紫红色），加一滴0.1%亮绿水溶液对染一分钟，吸去亮绿液，加一滴清水或45%醋酸水溶液压片镜检。
（五）试剂配制 称1g碱性品红于200ml煮沸的重蒸馏水中，5分钟后断电使其冷却至55～50℃，过滤到一个棕色的试剂瓶中，加入1N HCl 20ml，继续冷却至25℃，加入1g偏亚硫酸氢钠，摇动瓶子使其溶解。密闭瓶口，置黑暗低温处或冰箱内（4℃左右），18～24小时后检查，试剂如透明无色或呈浅黄色时即可使用，这就是Schiff试剂溶液。如有不同程度的红色未褪，可加入1g活性炭，强烈震荡一分钟，仍在低温下静置过夜，然后用滤纸过滤后使用。密封瓶口，包以黑纸，在5℃以下冰箱内可以保存半年。
漂洗液 在200ml蒸馏水中，加入10ml 1N HCl 和10ml 10%偏亚硫酸氢钠水溶液（或1.0g固体）。此液在临用前配制。
1N HCl 准确量取86.2ml浓盐酸（比重1.18）加入到913.8ml蒸馏水中。