大肠杆菌营养缺陷型菌株的筛选

把维生素B₁、B₂、B₆，泛酸，对氨基苯甲酸（BAPA），烟碱酸及生物素等量研细，充分混合，配成混合维生素。

3.生理盐水：NaClO.85克，蒸馏水100毫升，高压灭菌15磅/英寸²15分钟^*。

四、实验说明

微生物中筛选营养缺陷型的步骤包括诱变处理、淘汰野生型、检出缺陷型、鉴定缺陷型四步。由于不同微生物和诱变剂的特性差异，所以在实际工作中，应根据具体情况而适当变动，现分别补充说明。

当选用化科诱变剂进行诱变处理时，首先应根据诱变剂的特性，确定用何种诱变剂。化学诱变剂根据它们的诱变作用可以区分为三种：1.通过掺入DNA分子而引起突变，必须通过代谢作用。属于这一类的诱变物质如碱基类似物。2.通过和DNA直接起化学反应而引起突变。多数化学诱变剂属于这一类如亚硝酸等。3.通过一对核苷酸的插入或缺失而引起突变如吖啶类物质。

化学诱变剂的剂量也以相对剂量表示。相对剂量与三个因素有关：诱变剂浓度，处理温度和处理时间。一般通过处理时间来控制剂量。处理前诱变剂和菌液分别预热，以便当二者混合后即可计算处理时间，才能精确控制剂量。处理时间应按不同的处理菌而有所区别，最适剂量应事先进行预备试验确定。

浓缩缺陷型的方法有青霉素法、菌丝过滤法，差别杀菌法、饥饿法等，这些方法适用于不同的微生物。细菌应用青霉素浓缩法，酵母菌和霉菌的缺陷型筛选可以用制霉素代替青霉素。放线菌和霉菌可用菌丝过滤法，它们的野生型孢子能在基本培养液中萌发并长成菌丝，缺陷型的孢子不能长成菌丝。所以把经诱变处理的孢子悬浮在基本培养液中振荡培养，在培养过程中过滤几次，每次培养时间不宜过长，这样才能充分浓缩。

^*高渗青霉素法在2N基本培养液中加20％蔗糖和0.2％MgSO₄·7H₂O。

营养缺陷型的检出方法有逐个测定法、夹层培养法、限量补给法、影印培养法等。现简述如下：夹层培养法，先在皿底倒一层不含细菌的基本培养基，待凝后加上一层含菌的基本培养基，冷凝后再加上一层不含菌的基本培养基。经培养出现菌落以后在培养皿底上把菌落做上标记，然后加上一层完全培养基，再经培养以后出现的菌落多数是营养缺陷型。影印培养法，将经处理的细菌涂在完全培养基的表面，待出现菌落以后，用灭菌丝绒将菌落影印接种到基本培养基表面。待菌落出现以后比较两个培养皿，凡在完全培养基上出现菌落而在基本培养基上的同一位置上不出现菌落者，这一菌落便可以初步断定是一个缺陷型。

五、实验步骤

1.菌液制备：

（l）实验前14—16小时，挑取少量K12SF 菌，接种于盛有5毫升肉汤培养液的三角瓶中，置37℃培养过夜。

（2）第二天添加5毫升新鲜的肉汤培养液，充分混匀后，分装2只三角瓶，继续培养5小时。

（3）将两只三角瓶的菌液分别倒入离心管中，离心（3，500转/分）10分钟。

（4）倒去上清液，打匀沉淀。其中一管吸入5毫升生理盐水，然后倒入另一离心管，二管并成一管。

2.诱变处理：

（1）吸上述菌液3毫升于培养皿内，将培养皿放在15W的紫外灯下。距离28.5厘米。

（2）处理前先开紫外灯稳定30分钟，将待处理的培养皿连盖放在灯下灭菌1分钟，然后开盖处理1分钟。照射毕先盖上皿盖，再关紫外灯。

（3）吸3毫升加倍肉汤培养液到上述处理后的培养皿中。置37℃温箱内，避光培养12小时以上。

3.青霉素法淘汰野生型：

（1）吸5毫升处理过的菌液予已灭菌的离心管，离心（3，500转/分）10分钟。

（2）倒去上清液，打匀沉淀，加入