|
***生物素母液：2毫克生物素/100毫升。
（6）补充培养基：
a.基本固体培养基100毫升加组氨酸3.5毫克。
b.基本固体培养基100毫升加腺嘌呤3毫克。
五、实验步骤
1.取盛有完全固体培养基斜面的试管4支。把ade-和Hisl-两菌种各接种在二支斜面上。30℃温箱中培养24小时。
2.用5毫升生理盐水洗下一支ade-斜面上的菌，再倒入另一支ade-试管中，洗下的菌最后倒入无菌离心管中。另取5毫升生理盐水洗下Hisl-二支试管斜面的菌，倒入无菌离心管中。这样制成的菌液，浓度约108/毫升。
3.两亲本菌液各吸0.5毫升，放入5毫升完全液体培养基中，30℃静止培养2小时。
4.离心（3000转/分，3分钟），30℃静止培养半小时。
5.倒去上清液，打匀管底菌块，再加入6毫升新鲜完全液体培养基，30℃培养过夜。
6.离心，倒去上清液。再加6毫升新鲜完全液体培养基，洗一次，离心，倒去上清液。
7.将离心管中的沉淀菌接种在产孢子培养基斜面上，30℃培养2—3天。在显微镜下观察杂交后形成的子囊，可见其中有4个子囊孢子。
8.测定子囊孢子的表型推断其基因型：
（l）在长有子囊的斜面上加基本培养液2毫升，用接种环将子囊刮下，倒入无菌离心管中。
（2）在55°—60℃的恒温水浴中加热15分钟，杀死酵母菌的营养体，即单倍体细胞。离心，倒去上清液，加生理盐水到原体积，形成子囊悬液。
（3）把孢子悬液倒入消毒过的盛有石英砂的三角烧瓶中，振荡5分钟，使子囊孢子散出，成为子囊孢子悬液。
（4）取打散的子囊孢子悬液0.1毫升涂布在完全培养基培养皿上，30℃培养48小时。
（5）影印培养：以上面的培养皿为原始培养皿，依次影印：a.基本培养基；b.腺嘌呤补充培养基；c.组氨酸补充培养基；d.完全培养基。30℃培养48小时。
（6）生长谱鉴定：
a.从原始培养皿上挑取各个已经初步鉴定的菌落，接种在完全培养基斜面上。同时接种在有5ml液体完全培养基的离心管中，30℃培养48小时。
b.离心（3000转/分，3分钟。），倒去上清液，打匀沉淀，然后离心洗涤三次，最后加生理盐水至原体积。
C.吸取菌液0.1毫升，移至灭过菌的空培养皿中。然后倒入融化后冷至40°—50℃的固体基本培养基，摇匀，待凝。各做1皿。
d.在每一培养皿的皿底划分四格，两格放少量组氨酸结晶粉末，另两格放少量腺嘌呤的结晶粉末。然后放到30℃温箱培养48小时。
e.观察生长情况，营养缺陷型菌株会在所需物质的周围长出来。如需要两种物质，就只能在两种物质都扩散到的地方生长。
操作步骤见图11-2。
9.实验步骤说明：
（1）步骤3—6，是为了用营养丰富的培养基培养好的新鲜细胞，并使不同接合型的细胞充分接触，形成合子，为产生孢子创造条件。
（2）步骤7中，由于酵母在产孢子培养基上不会增殖，所以要求接种足够多的细胞，使杂交形成的子囊不至于过少。
（3）步骤8（3），要从子囊中取得子囊孢子，也可用蜗牛酶充分处理子囊后，用超声波处理使子囊孢子充分分散。蜗牛酶处理温度为30°—37℃，15—30分钟。没有蜗牛酶，用石英砂振荡，也能使子囊壳破碎，散出子囊孢子。
上一篇：大肠杆菌杂交 下一篇：大肠杆菌营养缺陷型菌株的筛选 共3页: 上一页 [1] 2 [3] 下一页 | 
