大肠杆菌杂交

一、实验原理

Lederberg和Tatum（1946）选用典型的大肠杆菌为材料，筛选营养缺陷型。利用双重和三重缺陷型的菌株，在简单的合成培养基上混合培养，在此培养基上只有重组子能长，亲本不能长，即所谓选择性培养，使细菌杂交获得成功。图12-1说明了细菌的基因重组是不同基因型的细菌经接触，接合后随之发生交换和杂种细菌分离的过程。

大肠杆菌的杂交试验中发现有些菌株经混合培养能得到重组子，有些却不能。1952年Hayes做了一个实验，他所用的二个菌株是菌株A和菌株B。菌株A是不能合成甲硫氨酸和生物素；菌株B是苏氨酸、亮氨酸和维生素B₁的三重缺陷型。Hayes首先筛选链霉素抗性突变型AS^r和BS^r，然后在不含链霉素的基本培养基上进行正反杂交，结果没有不同，但在含链霉素的基本培养基上进行正反杂交，结果却不一样，在AS^s×BS^r杂交中能得到重组子，可是AS^r×BS^s杂交中却并不出现重组菌落。这一现象说明大肠杆菌中有不同的“性”，它与致育因子F有关。同时按细胞中有无F因子将大肠杆菌分为二类，有F因子的为F ，没有F因子为F^-。F因子是一个小的DNA环状分子，分子量约4.5×10⁶道尔顿。带有F因子的细胞，表面有一种称为性菌毛的毛状突起，长约1至20μ。性菌毛上有雄性专一噬菌体（MS₂、k17、f₂、Qβ等）的吸附位点，又和细胞的接合有关。F因子在细胞中能以二种状态存在；游离状态和整合到寄主染色体的一定位置。以致带有F因子的大肠杆菌可分为二类：F 和Hfr菌株。经吖啶橙处理F 变为F^-，而Hfr性质不变，说明F因子在F 菌株中呈游离状态，而在Hfr菌株中则整合到寄主染色体的一定位置（图12-2）。

大肠杆菌杂交在F 与F^-菌株之间进行，通过细胞的暂时沟通，形成局部合子。在部分合子的形成中，提供部分染色体或少数基因的菌称为供体菌，提供整个染色体的菌称为受体菌；所以F 和Hfr是供体细菌，F^-是受体菌。F 和F^-能杂交，Hfr和F^-也能杂交，F^-和F^-则不能杂交；但这二个可杂交组合其特性不同，主要表现在：1.Hfr细菌和F^-细菌杂交以后F^-细菌性质不变，F 和F^-细菌杂交以后F^-细菌转变为F （约70％）。2.F 和F^-细菌杂交重组频率10^-6，Hfr和F^-细菌杂交重组频率高出F 菌株几百倍，称高频重组。

在F 与F^-杂交中，F因子由F 供体高频转移到F^-受体，低频转移宿主染色体的标志。原因是F 群体中每个细胞能转移性因子到F^-受体，只有小部分细胞能转移染色体的标记。在Hfr与F^-杂交中，Hfr供体的染色体由原点（在F因子内）开始转移进入受体菌，在这过程中F因子被割裂，F因子基因，一些是首先进入，另一些是最后进入。在这类杂交中只有当交配过程长到足以允许整个供体染色体被转移入F^-受体，受体细胞才能由F^-变为Hfr。

杂交实验有多种不同方法，这里介绍的是直接混合培养和液体培养。直接混合培养法操作简单，适用于确定二个菌株间能否杂交或测定重组频率的高低，而液体培养适宜于细菌的基因定位。

二、实验材料

大肠杆菌（EscherichiacoliK12）的四个菌株：K12Pro（λ）F ；W1485HisIleF ；W1177ThrLeuthixylGalaramtl mallacstrr（λ）F^-；HfrCMetTrp。

Pro：脯氨酸，（λ）：原噬菌体整合在染色体上，His：组氨酸，ilv：异亮氨酸缬氨酸，Thr：苏氨酸，Leu：亮氨酸，thi：维生素B¹，xyl：木糖，Gal：半乳糖，ara：阿拉伯糖，mtl：甘露醇，mal：麦芽糖，lac：乳糖，str^r：链霉素抗性，Met：甲硫氨酸，Trp：色氨酸。

三、实验器具和药品

1.用具：灭菌培养皿（9厘米），灭菌三角瓶（150毫升），灭菌吸管（1、5、10毫升），灭菌离心管，灭菌空试管。

2.培养基：

（1）基本培养基Vogel50×^*：MgSO₄·7H₂O10克，柠檬酸100克，NaNH₄HPO₄·4H₂O175克，K₂HPO₄500克（K₂HPO₄·3H₂O644克），蒸馏水约1，000毫升^**（配好后放入冰箱保存备用）。

（2）平板用基本培养基：Vogel50×2毫升，葡萄糖2克，琼脂2克^***，蒸馏水98毫升，pH7.0，高压灭菌8磅/英寸²30分钟。

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