啤酒酵母菌营养缺陷型菌株的筛选

四、实验说明

1.本实验采用的诱变剂是一种超诱变剂，因此安全操作十分重要。称量时，最好在某一固定地方，戴好橡皮手套和口罩在密闭箱里进行，以防止NTG颗粒吹散。操作时，不能用嘴直接吸取含有NTG的液体，应改用洗耳球吸取。凡含有NTG的器皿和用具都要用浓碱处理。

2.利用酵母菌进行诱变工作，首先要获得单倍体菌株。在二倍体细胞中，隐性性状（突变往往是隐性）不能表现。而单倍体细胞，隐性突变性状就能直接表现。因此，获得单倍体细胞对诱变工作来说是重要的。

一个简单的办法是：利用营养细胞和子囊孢子的耐热性差异进行热处理，就能很容易得到单倍体细胞。具体做法是把二倍体营养细胞接种于产孢子培养基的斜面上，用5毫升无菌水制成悬浊液，将此悬浊液浸于55℃—60℃恒温水浴中，不断振荡处理约10分钟（处理时间，根据对营养细胞耐热性预备试验而定。一般以约10⁶—10⁷的营养细胞菌悬液经一定时间处理后，用接种环挑取一环菌液接种于完全平板或斜面，30℃培养2天后，看完全不生长或只有一两个菌落生长为标准作为所需的处理时间）。处理后，用自来水迅速冷却，适当稀释涂布于完全培养基平板，30℃培养2天后，用接种环挑取较小的圆锥形菌落镜检，从形态上判断单倍体细胞。用这方法，一般要划线纯化后较为可靠。为了进一步提高可靠性，可接种于产孢子培养基上看是否产孢子来确定。如先用一定浓度的纤维素酶处理，再进行热处理可提高获得单倍体细胞的效率。

五、实验步骤

1.制备菌悬液

（1）将酵母菌单倍体菌株^#26—4（或143—2）从保存斜面上，用接种环挑一些菌，接种到盛有5毫升完全液体培养液的灭菌离心管中，28℃—30℃培养16—18小时，共接2支。

（2）将培养过的菌液倒入盛有玻璃珠的灭菌三角瓶中，振荡10分钟，使酵母菌充分均匀分散。

（3）将上述菌液各吸4毫升于2支灭菌离心管中离心（3500转/分，10分钟），倒去上清液，打匀菌块，各加4ml无菌水制成菌悬液，并存放在30℃水浴中备用。

2.活菌计算（用没有经NTG处理的菌液作对照）

（l）从30℃水浴中取出一支菌悬液（4毫升），加生理盐水1毫升，然后再用生理盐水稀释到10^-4、10^-5。

（2）从10^-4或10^-5稀释液中吸取0.1和0.5毫升于灭菌培养皿中，各做二皿，共四皿。

（3）将熔化不烫手的完全固体培养基倒入上述含菌的培养皿中（每皿约倒入培养基15—20毫升），摇匀、放平待凝，30℃培养二天，计算活菌数。

3.诱变处理

（1）称取NTG1.5毫克于灭菌的离心管中，然后加入1毫升pH6.00.2mol/L磷酸缓冲液，使其完全溶解，并存放在30℃水浴中备用。

（2）从30℃水浴中取出另一支菌悬液（4毫升），倒入上述含有NTG的离心管中（此时NTG最终浓度为300γ/毫升），充分混匀，立刻放入30℃水浴中，同时计算时间，30分钟后取出，立即离心（3500转/分），将上述废液倒入浓NaOH溶液中，打匀菌块，加5毫升生理盐水，再离心（3500转/分）一次，倒去废液，加5毫升无菌水制成菌悬液。

（3）将熔化不烫手的完全培养基倒入灭菌培养皿中（每皿15—20毫升），放平待凝，共20皿。

（4）将经NTG处理过的菌液稀释为10^-3（希望每只培养皿中长50—100个菌落），吸取0.1毫升和0.05毫升于上述预先倒好的培养皿中，各倒10个皿。

（5）用灭过菌的Y形玻璃涂棒将菌液涂匀，30℃培养3—4天，计算活菌数。

（6）计算杀菌率及存活率（从诱变组中选择不污染、菌落分布均匀、菌数适中的培养皿留作下步影印备用）。

4.影印

（1）准备好影印用丝绒布（高压灭菌，干燥箱内烘干备用）。

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