EST技术及其在基因全长cDNA克隆上的应用策略

第二军医大学细胞生物学教研室；上海200433　何志颖；姚玉成（综述）；胡以平（审校）

关键词：EST技术；“电子”基因克隆；生物信息学；基因

摘要： 随着人类基因组计划的顺利进行，EST技术被广泛应用于基因识别、绘制基因表达图谱、寻找新基因等研究领域。利用人类基因组研究不断产生的数据，从ESTs即cDNA的部分序列入手，通过同源筛选，获得基因部分乃至全长cDNA序列，避免或减轻了构建与筛选cDNA文库等繁锁实验室工作。本文从原理、应用及其在科学研究上产生的影响等方面对EST技术进行了概述。

表达序列标签（expressed sequence tags,ESTs）是指从不同组织来源的cDNA序列。这一概念首次由Adams等于1991年提出。近年来由此形成的技术路线被广泛应用于基因识别、绘制基因表达图谱、寻找新基因等研究领域，并且取得了显著成效。在通过mRNA差异显示、代表性差异分析等方法获得未知基因的cDNA部分序列后，研究者都迫切希望克隆到其全长cDNA序列，以便对该基因的功能进行研究。克隆全长cDNA序列的传统途径是采用噬斑原位杂交的方法筛选cDNA文库，或采用PCR的方法，这些方法由于工作量大、耗时、耗材等缺点已满足不了人类基因组时代迅猛发展的要求。而随着人类基因组计划的开展，在基因结构、定位、表达和功能研究等方面都积累了大量的数据，如何充分利用这些已有的数据资源，加速人类基因克隆研究，同时避免重复工作，节省开支，已成为一个急迫而富有挑战性的课题摆在我们面前，采用生物信息学方法延伸表达序列标签（ESTs）序列，获得基因部分乃至全长cDNAycg，将为基因克隆和表达分析提供空前的动力，并为生物信息学功能的充分发挥提供广阔的空间。文本将就EST技术的应用并就其在基因全长cDNA克隆上的应用作一较为详细的介绍。

1、ESTs与基因识别

EST技术最常见的用途是基因识别，传统的全基因组测序并不是发现基因最有效率的方法，这一方法显得即昂贵又费时。因为基因组中只有2%的序列编码蛋白质，因此一部分科学家支持首先对基因的转录产物进行大规模测序，即从真正编码蛋白质的mRNA出发，构建各种cDNA文库，并对库中的克隆进行大规模测序。Adams等提出的表达序列标签的概念标志着大规模cDNA测序时代的到来。虽然ESTs序列数据对不精确，精确度最高为97%，但实践证明EST技术可大大加速新基因的发现与研究。Medzhitov等通过果蝇黑胃TOLL蛋白进行dbEST数据库检索，该蛋白已证实在成熟果蝇抗真菌反应中发挥重要作用，通过同源分析的方法，找到相应的人类同源EST（登录号为H48602），这为接下来研究人类TOLL同源蛋白的功能提供了很好的条件。hMSH5基因是从酿酒酵母菌MSH5存在30%的一致性，它与hMSH4特异性相互作用，在减数分裂和精子发生过程中发挥一定的作用。由此可见，应用EST技术，可以跳过生物分类学的界限，从生物模型的已识别基因迅速