定位候选克隆

当前，人类基因组研究的重心正在由“结构”向“功能”转移，一个以基因组功能研究为主要内容的所谓“后基因组时代”(post-genomics)，也即功能基因组(functional genomics)时代，即将到来。如何获取基因的功能信息，即与人类重大疾病和重要生理功能相关的基因信息，就摆在了我们面前。定位候选克隆策略(positional candidate cloning)是传统定位克隆(positional cloning)的改进和发展，并以其在克隆疾病相关基因中的有效性而日益受到重视。
　　人类基因组计划已确定了一系列分布于全基因组24条染色体上的分子标记。根据这些分子标记的序列和定位信息，结合杂交或PCR的方法可以快速检测染色体上与肿瘤或遗传性疾病相关的热点位置，进而从中克隆疾病相关基因。定位候选克隆克服了经典的定位克隆纯粹依靠连锁分析进行染色体定位的繁冗而缓慢的弊端，大大加快了克隆工作的进程，而且它也不仅仅局限于遗传病，现在已更多地运用于肿瘤易感基因的克隆工作。1994年国际上开始构建并于1996年首次公布的基因图谱是一个以cDNA为基础的STS(sequence-tagged site)标记的物理图和多态性微卫星标记的遗传图相结合的图谱，它一方面使染色体定位更加准确、可靠、精密，同时为从候选区域内获得疾病相关的候选基因提供了极大的便利，使得目的基因的克隆更加简便而快捷，为这种方法的发展和应用注入了更大的活力，表现为此后相继克隆出16条新的疾病相关基因，如从胰腺癌中分离得到的抑癌基因DPC4等。1998年10月GeneBank公布了最新的“基因图谱98”，它的信息量更大，且准确度和精确度都有大幅度的提高，包含有41 464个STS标记，代表了30 181条基因的定位信息，也即完成了人的全部基因组约6万～7万条基因中的一半左右的定位工作［2］。总之，随着人类基因组计划的推进，定位候选克隆已成为一种有效的克隆疾病相关基因的方法。
　　定位候选克隆包括三个基本步骤：基因组定位、候选cDNA的获得、全长及功能分析。本文即对此策略的发展和应用作一概要介绍。
　　1.基因组定位
　　新发展起来的，尤其在分离肿瘤易感基因中常用的方法是用PCR方法检测多样本的杂合性丢失(LOH)或纯合性丢失的高发频率区，从而获得疾病候选基因定位［3］。体细胞抑癌基因的失活是导致癌变的一个主要因素，最常见的表现即杂合性缺失。通常在染色体上杂合性缺失的高发频率区含有一个或多个抑癌基因。利用散布于各条染色体上的分子标记(包括STS、微卫星标记等)，用PCR检测多个肿瘤样本的染色体各区带的缺失情况，可确定LOH的高发频率区，也即确定了相关肿瘤生长负调控因子的染色体定位，并可精确到基因组