DNA序列分析（DNA sequencing） 应用各种突变检测技术检测到的基因突变，最后都需用序列分析才能确定突变类型及突变位置，其效率可以达到100％。现在的测序方法已与经典的方法有了很大的不同，其基本原理虽仍是双脱氧终止法，但自动化程度大为提高，操作更简便，测序时间也大大缩短。随着PCR技术与测序联合使用，不需经过M13亚克隆步骤，故称为直接测序法（direct sequencing,DS）。DS法测序的模板主主要来源于PCR，应用不对称PCR（asymmetric PCR）和基因组扩增转录同步测序法（genomic amplification with transcript sequencing,GAWTS）等，使单链产物大大增加。近年来，PCR循环测序法的建立，使模板扩增与同步进行，引物用四种不同前颜色的荧光标记，使每个样品的四个测序反应可在一个反应管和一个泳道内进行，大大提高了测邓的自动化程度。目前PE公司推同出的DNA自动测序仪已发展到96泳道，并仍在不断改进。这些高度自动化的测序方法是经较理想的基因突变分析技术，但其昂贵的费用其使用范围，所以对一些小样本或为了某些特定目的的样本分析，仍进行经典的手工测序。
突变基因的检测方法多种多样，特别是PCR技术诞生后，许多检测技术都是在PCR基础上衍生的。由于PCR扩增南非要的模板量少，使对肿瘤的突变分析可以精确到单细胞，如霍奇金病的R-S细胞的单细胞基因突变分析。另外，应用显微解剖法（microdissection）可在组织切片上较精确地挑选需检测的靶点，其优点是可克服肿瘤组只中间质或癌周组织的混杂，提高准确性。除上述介绍的方法外，还有多种方法也用于基因突变的分子检测，如对未知突变基因进行分析的酶促切割错配法（enzyme mismatc cleavage,EMC）、切割片段长度多态性（cleavage fragment length polymor phism,CEFLP）、双脱氧指纹图谱法（dideoxy finger printing,ddF）、错配接合蛋白质截短测试法（protein truncation test,PTT）等。对已知突变基因进行分析 的有引物延伸法（primer extension,PEX）、寡核苷酸链接检测法（oligonucleotide ligation assay,OLA）、毛细管电泳法（capillary electrophoresis,CE）等方法。
肿瘤的微卫星不稳定性分析
微卫星不稳定性
微卫星不稳定性（microsatellite instability,MI）检测是基于VNTR的发现，细胞内基因组含有大量的碱基重复序列，一般将6-7bp的串联重称为小卫星DNA（minisatellite DNA）,又称为VNTR。而将1-4bp的串联重复称为微卫星DNA，又称简单重复序列（simple repeat sequence,SRS）。SRS是一种最常见的重复序列之一，具有丰富的多态性、高度杂合性、重组纺低等优点。最常见的为双核苷酸重复，即（AC）n和（TG）n。研究表胆，在n≥104时，2bp重复序列在人群中呈高度多态性。SRS广泛存在于原核和真核基因组中，约占真核基因组的5％，是近年来快速发展起来的新的DNA多态性标志之一。策卫星稳定性（MI）是指简重复序列的增加或丢失。MI首先在结肠癌中观察到，1993年在HNPCC中观察到多条染色体均有（AC）n重复序列的增加或毛失，以后相继在胃癌、胰腺癌、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌及其他肿瘤等也好现存在微卫星不稳定现象，提示MI可能是肿瘤细胞的另一重要分子结果显示 ，MI与肿瘤与发展有关，MI仅在肿瘤细胞中发现，从未在正常组织中检测到。在原发与移肿瘤中，MI均交分布于整个肿瘤。晚期胃癌的MI频率显著高于早期胃癌。
微卫星不稳定性的检测
MI分析比RFLP及其他Southern杂交方法简易快速，基本方法为首先用PCR技术扩增所需的双核酸重复序列，然后在DNA序列分析凝胶电泳。MI分析是与PCR技术联系在一起的，由此也衍生出不同的方法和引物标记物，如用核素标记，电泳后的凝胶干燥后放射自显影观察。近年来还引入了片动化分析系统，可用荧光素取代核素。分析时条带长度的确定可用已知长度梯度标准带分为参照，也可以用频度最高的带（优势带）为基准。由于MI可对单个细胞时行检测，并可对石蜡包埋的组织进行回顾性研究，结合显微解剖（microdissection）技术，可以使检测的目的更明确。
肿瘤易感性检测
目前研究发现，有一部分恶性肿瘤的发生具有遗传学基础，故肿瘤遗传易感性的检测对于肿瘤高危人群的筛检及确定具有较大的实用价值。已知的肿瘤易感性基因有Rb1,WT1,p53、APC、hMSH2,hMLH1和BRCA1等，与其相对应的癌症综合征（附录表5）。
附录表5 遗传性癌症综合征与易感基因
癌症综合征 易感基因
视网膜母细胞瘤 Rb1
Wilms瘤 WT1
LI-Fraumeni综合征 p53
家族性腺瘤性息肉瘤（FAP) APC
遗传性非息肉性结肠癌（HNPCC） hMSH2,hMSH1
乳腺吕
卵巢癌 BRCA1
APC基因突变与FAP的发生有关，其在大肠肿瘤的突变发生率可达60％以上。研究者利用PCR-RFLP方法检测FAP家系的APC基因1309-1311位点的点突变，发现一个家系中有2个成员有点突变发生，经纤维镜检查证实2例均属于FAP患者。由于APC基因较大，且其突变点较分散，故用APC基因点突变检测不宜筛检大肠癌。最近Powell等使用体外翻译结合等位基因特异性表达试验检测了62例FAP患者，使APC基因突变检出率达到87％（54/62），对于大肠癌的早期发现具有较高的应用价值。对遗传性非息肉病性结肠癌（HNPCC)的病因研究也取得了突破，发现HNPCC的发生与大肠村菌DNA错配修复系统（mutS、mutL、mutH）相似的人类基因hMSH2、hMLH1的突变有关，有60％HNPCC与hMSH2突变有关，30％HNPCC与hMSH1突变有关。目前国外已开始对上述基因突变检测方法进行研究，以期找到发现所有HNPCC的实用基因诊断方法。
另外，还有一些方法可用于正常人的肿瘤易感性检测，如检测RET基因突变用于诊断Ⅱ型多发性内分泌肿瘤；BRCA1连锁分析用于家族性乳腺癌和卵巢癌的诊断；分析谷胱甘肽S转移酶基因型来判断个体致癌危险性等。
肿瘤相关病毒
业已证明一部分肿瘤的发生和病毒感染有关，因而检测这些相关病毒不仅可探计肿瘤和病毒的关系，而且可以找出肿瘤的易患人群。由于病毒太小，且难以培养，一般方法检测病毒效果极差。而核酸杂交技术与PCR技术用于病毒检测具有特异性强、敏感性高等特点。分子生物学技术能用于研究人乳头状瘤病毒（HPV）各亚型与良、恶性子宫颈病变的关系，且发现在子宫颈湿疣中存在HPV6、11亚型，在宫颈上皮内新生物和癌中，则存在16、18亚型，且HPV16、18亚型在胞质中位于中间丝和液泡间，核中位于附加体、液泡和染色质中。但在正常子宫颈组织和已治愈的宫颈新生上皮内且病变无复发的患者中，也有人发现HPV亚型（包括16亚型）。这些结果提示HPV与子宫颈新生物间存在复杂的关系，包括年龄因素、细胞内自身失控等。另外，报道在肿瘤性子宫颈细胞内查出了单纯疱疹病毒（HSV）特异性mRNA及巨细胞病毒（CMV）DNA,宫颈恶性病变与HSV及CMV有关。除HPV外，其他病毒与肿瘤之间的关系通过研究也得到进一步证实。利用分子生物学技术检测肝癌细胞内整合型乙型肝炎病毒（HBV）及游离型HBV DNA,在原发性肝癌中其整合率可达90％，这对进一步说明HBV与原发性肝癌发生的关系具有重要意义。另外在霍奇金病和鼻咽癌的发生有密切关系。而在非霍奇金淋巴瘤（NHL）细胞中也曾检测到了HSV6型。有报道在人葡萄胎中发现了微小病毒，为研究葡萄胎的发生与微小病毒的关系提供了依据。利用原位杂交技术，可检测到白血病患者经过骨髓移植治疗后死亡的尸检组纪念品中的CMV DNA及卡波氏肉瘤组织内的CMV DNA。研究初步证实，ATL病毒可引起成人T细胞白血病/淋巴瘤（ATL/ATLL）。
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