9.双温PCR（two-temperature PCR）仅仅执行两步温度程序。合并退火与延伸温度。一般常用温度是94-95℃和46-47℃。可以提高反应的速度和特异性。
上述这些PCR技术的应用：（1）PCR技术扩增特定序列为基础，采用多种方法进行检测，如PCR-RFLP、PCR-SSCP从已克隆的双链DNA中产生特异性序列作为分子探针；（2）通过选择性扩增cDNA中产生特异性序列作为分子探针；（2）通过选择性扩增cDNA中的特殊片段，产生针对尚未克隆的基因的探针；（3）从微量mRNA中产生cDNA文库；（4）产生大量用于序列分析的DNA；（5）分析 基因突变；（6）做染色体步移。
10.原位PCR技术：PCR虽然能扩增包括福尔马林固定、石蜡包埋组织的各种标本的DNA，但扩增的DNA或RNA产物不能在组织细胞中定位，因而不能直接与特定的组织细胞特征相联系，这是该技术一个局限性。原位杂交虽具有良好的定位能力，但由于其敏感性问题，尤其是在石蜡切片中，尚不能检测出低含量的DNA或RNA序列。而原位PCR（In situ PCR,简称IS PCR），它可使扩增的特定DNA片段在分离细胞和组织切片中定位，从而弥补了PCR和原位杂交的不足，具有良好的应用前景。目前，已有多种设计的原位PCR扩增仪系统问世，使操作简便，软件灵活，已成为拉增固定细胞和石蜡包埋组织中特定DNA和RNA序列的有用工具。
IS PCR的技术特点
（1）既具有PCR的特异性与高灵敏性，又具有原位杂交的定位准确性；（2）测到低于2个拷贝量的细胞内特定DNA序列，甚至可检测出单一细胞中的仅含一个拷贝的原病毒DNA；（3）有助于细胞内特定核酸序列定位与其形态学变化的结合分析；（4）可用于正常或恶性细胞，感染或非感染细胞的鉴定与区别。
IS PCR的基本方法
IS-PCR是PCR和原位杂交两种技术的绫事，实质是一种将靶DNA或RNA在原位扩增后再进行原位杂交的技术，操作程序基本兼有两种技术的所有过程，首先在适当处理的细胞和组织切片上滴加PCR反应液，然后把载玻片放入热循环仪中进行扩增，最后通过标记的探针进行原位杂交检测扩增产物。
初步应用
有关原位PCR技术应用成功的第一篇报道是对感染绵羊中枢神经系统visna病毒在绵羊脉络从一细胞中检查，通过PCR扩增，仅用150碱基对的短探针就可通过ISH检查到了细胞内的visna病毒。从开始在试管内细胞行PCR扩增后再涂片做ISH(原位杂交)检查，已发展到用福尔马林固定、石蜡切片的常规病理组织方法做原位PCR检查。有传统的标记探针的原位PCR法（间接法），也有将标记物先标记PCR的引物，让标记物扩增后再行ISH检查的直接法。因此，目前就原位PCR方法而言，尚未能获得统一，也即未能比较出哪一种方法最可靠简便，各家报道的原位PCR技术中，在标本处理和种类上尚不同（细胞悬液、涂片、组织切片等），想检测的靶核酸也不同（病毒或体细胞的DNA或mRNA），扩增的方法上有不同（单引物、多引物），最后显示的方法也不同（直接法、间接法）。这些还都有待在今后的工作中积累经验，以求一致。
原位PCR应用的课题，目前正片于开始阶段，还很局限，对人体B细胞淋巴瘤中Ig单拷贝基因重组的检查以及对人体外周血中单核细胞HLA-DQ不同亚型的测定，归纳起来，主要应用于两方面；（1）检测外源怀基因片段，集中在病毒感染的检查上，如HIV、HPV、HBV、CMV等；（2）内源性基因片段，如人体的单基因病、重组基因、易位的染色体、Ig的mRNA片段、癌基因片段等。
基因转染技术
将特定的遗传信息传递到真核细胞中，这种能力不但革新了生物学和医学中许多基本问题的研究，也推动了诊断和治疗方面的分子技术发展，并使基因治疗成为可能。目前基因转移技术已广泛用于基因的结构和功能分析、基因表达与调控、基因治疗与转基因动物等研究。本部分将介绍目前基因转移的主要方法；重点介绍基因转移的病毒方法的基因转染（transfection）技术。
基因运载系统
将某一特定的靶基因传递到靶细胞，需要应用某一基因运载系统，目前将这一系统概括为两大类：非病毒辣方法和病毒方法。
1.基因转移的非病毒方法
直接注射法 将含有DNA的溶液直接注射到肌肉，以引起邻近的细胞摄入DNA燕进行表达，在肌细胞中，基因表达可持续数月。
磷酸钙共沉淀法 将氯化钙、DNA和磷酸盐缓冲液混合，形成磷酸钙微沉淀 ，附着于细胞膜并经过细胞内吞作用耐是入细胞质。该方法的转化效率通常很低。
脂质体染法 指质体能在体内或体外提供运载外源性遗传物质进入细胞的载体。脂质体介导的基因转移的最大优势在于能在活体内应用。
受体介导的基因转移 依靠受体介导的细胞内吞途径以转移外源基因。受体介导的基因转移方法是在质粒DNA和某种特异的多肽（配体）之间形成复合体，而这种多肽能为细胞表面的肥体所识别。如若将DNA在体内运送至肝内，可以选将DNA和能与肝细胞受体特异结合的去唾液酸糖蛋白质偶联，以便通过细胞内吞过程而被摄入，这种DNA大部分被肝脏所摄取。应用该方法转移的外源基因在活体内的表达持续时间较短，在评估实际应用前影上还在一些问题。
显微注射法 在显微镜下，将DNA经同细胞玻璃针地接注入细胞，该法适合于各种培养生长的细胞，但需要一定的设备和操作用支巧。
电穿孔法 利用脉冲场将DNA导入培养细胞。
微粒子轰击法（基因枪）近几年发展较快的转移方法。使用高能微粒子轰击将DNA导入培胞或活的哺乳动物组织内。亚微粒的钨和金能自发地吸附DNA，将这些微弹加强速到很的速度轰击细胞。实验结果表明，用这种方法靶基因可在皮肤、肌肉、肝、胰、胃和乳腺等细胞中表达。
胚胎干细胞法 胚胎干细胞是从受精卵开始分裂至4个国胞阶段未分化和具有多种潜能的生殖细胞，能在体外培养，可作为正面细胞，制备转基因动物，以研究基因定向整合或基因剔险及基因及能。
上一篇：一种挑取重组子克隆的简易方法-菌落PCR 下一篇：统计软件中的数据录入格式－SAS
共9页: 上一页 [1] [2] 3 [4] [5] [6] [7] [8] [9] 下一页
