| DNA分子标记技术基因克隆技术 | | 点击： 作者： 来源：基因酷 时间： 2007-10-24 本站论坛 |
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四、RAPD与RFLP的区别，RAPD与RFLP相比有何优缺点？
RAPD标记随机引物扩增多态性DNA（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD）是在PCR技术的基础上，以一系列不同随机排列碱基顺序的寡聚核苷酸单链为引物，结合到加热变性后的模板链上使之退火，在DNA聚合酶的作用下，合成一段新的互补DNA链。RAPD要求的引物可随机合成，但必须满足两个条件：G+C的含量不低于40%，一般为50%～70%；5′与3′端的碱基顺序非反方向对称，否则无法合成专一性的少数几条DNA片段。其长度以10个碱基为宜，太短（少于9个核苷酸长度）则难以结合到模板DNA分子上，太长则成本提高，且合成多态性DNA片段的可能性降低。
RFLP主要建立在酶切片段的分子杂交基础之上，DNA总量没有变化；而RAPD基于PCR技术通过放大作用，DNA总量增加。但是他们之间有许多相同之处，如：需电泳分析，遵守孟德尔定律，对DNA进行多态性分析等。
与RFLP相比，RAPD的优点有:（1）引物设计是随机的，故可在对各种生物没有任何分子生物学研究的情况下，对其进行DNA多态性分析。（2）所需模板DNA的量极少，只要有特定的DNA片段，就可将该DNA片段扩增。（3）引物为人工合成，通常一套引物可用于多物种的基因组DNA多态性分析。（4）每个RAPD标记就相当于一个靶序列位点（Sequence Tagged Sites），可定向增加RFLP某一区域的DNA标记数，更有效地进行遗传图谱的构建。
RAPD在实际应用中也表现出不足：（1）RAPD是显——隐性位点，故无法在F2代中知道其基因型（纯合体或杂合体），仍需进行F3代及以后世代的样品分析。（2）稳定性差，重复率低。（3）对模板DNA的纯度要求高。RAPD技术主要用于动物基因图谱的绘制。建立一个用于标记、定位和选择生产性状基因组的基因图谱，至少需要100～150个在染色体上均匀分布的RFLP位点，但由于RFLP主要分布于染色体端部，而RAPD分布较均匀，故运用RAPD标记对建立标记位点连锁图十分有用。此外，Ｔｍ低的随机引物，易受外界条件影响，如反应体系Ｍｇ2+浓度；使用不同引物导致产物信号差异太大，无法进行分析。
五、何为基因文库? 简述构建基因文库的过程。
基因文库：应用DNA重组技术，可以很容易的将各种生物体从比较简单的生物，如病毒、细菌到十分复杂的真核生物的全部基因组的遗传信息，贮存在可以长期保存的稳定的重组体中，以备需要时应用。这好象将文献资料贮存于图书馆一样，所以称为基因文库（genomic library）。
基因文库的构建步骤：1）DNA片段的制备。从生物组织中分离并纯化基因组DNA后，将DNA用限制酶进行部分或完全降解，将降解物（DNA片段）进行分级分离，除去太大及太小的片段，收集大小合适的片段并与载体连接。2）DNA片段与载体连接。常用λ噬菌体DNA作为建立基因文库的载体，因为它既在较高的克隆效率，又可以容纳较大的外源DNA片段。装备型载体（cosmid）也是常用的载体。DNA片段与载体用T4DNA连接酶连接。3）将重组体引入细菌细胞。体外包装λ噬菌体后，进行感染。或用转化使质粒DNA进入细胞。4）筛选鉴定基因组。用分子杂交，凝胶电泳，DNA序列测定等方法加以筛选及鉴定。
六、作为载体的DNA分子应具备哪些条件？
外源DNA片段要进入细胞，并在其中进行复制与表达，必须有一个适当的运载工具将其带入细胞内并载着外源DNA一起进行复制与表达。这种运载工具称为载体（vector）。载体必须具备下列条件：
1 在受体细胞中，载体可以独立地进行复制。所以，载体本身必须是一个复制单位，称复制子，具有复制起点。而且插入外源DNA后不会影响载体本身复制的能力。
2 易于鉴定、筛选。
3 载体DNA的分子应该较小，易进入受体细胞，可以在受体细胞扩增较多的拷贝，便于结合更大的目的DNA。在实验操作中不易被机械损伤。
4 在载体上应该具有两个以上的易检测的遗传标记。
5 载体应该具有多个RE的单一切点。
七、简述外源DNA表达的检测方法。
受体细胞经转化或转导处理后，真正获得目的基因并能有效表达的克隆子一般来说只是一小部分，而绝大部分仍是原来的受体细胞，或者是不含目的基因的克隆子。为了从处理后的大量受体细胞中分离出真正的克隆子，已建立了一系列的筛选和鉴定的方法，主要有以下几种。
1 利用克隆载体携带的选择标记基因筛选
目前常用的选择标记基因有抗菌素抗性基因和lac Z＇基因。
1.1 利用抗菌素抗性基因进行筛选
不同克隆载体通常分别携带Ampr（抗氨苄青霉素）、Cmpr（抗氯霉素）、kanr（抗卞那霉素）、Tetr（抗四环素）和Strr（抗链霉素）等抗性基因。当含任何一种抗菌素抗性基因的载体处理不具这种抗性基因的受体细胞，并在含有相应抗菌素的培养基上培养时，只有获得载体的受体细胞才能继续生长，这样便可筛选出含克隆载体的克隆子。
1.2 利用乳糖操纵子lac Z＇基因筛选克隆子
具完整乳糖操纵子的菌体能翻译β-葡萄糖苷酸酶（Z）、透性酶（Y）和乙酰基转移酶（A），当培养基中含有X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷）和IPTG（异丙基硫代-β-D-乳糖苷）时，可产生蓝色沉淀物，使菌落成蓝色。如含乳糖操纵子缺陷型（lac Z＇）的载体转化互补型菌株，在含有X-gal和IPTG的培养基中培养时，克隆子是蓝色菌落，而未转化的互补型菌株的菌落是白色的。当含有目的基因的DNA片段插入（lac Z＇）基因区，即使转化互补型菌株细胞，在含有X-gal和IPTG的培养基中，也是长出白色的菌落。由此可以根据菌落的蓝、白颜色筛选出含目的基因的克隆子。为区分含目的基因的克隆子与未被转化的受体菌（白色菌落），可在选择培养基中添加克隆载体其他选择标记药物。
2 利用双酶切片段重组法初筛克隆子
在无法利用克隆载体选择标记的情况下，可以考虑采用双酶切片段重组法。根据实验设计，选用两种限制性内切酶切割载体DNA分子，用凝胶电泳回收两端具不同粘性末端的线形载体DNA，并经碱性磷酸酶处理后，与同样用那两种限制性内切酶切割获得的含目的基因的DNA片段连接，转化受体细胞，在含克隆载体选择标记药物的培养基上培养，长出的菌落绝大部分是含目的基因的克隆子。
3 利用报告基因筛选克隆子
对于那些不宜用克隆载体选择标记筛选的克隆子的受体细胞，往往在含有目的基因的DNA片段与克隆载体连接之前，先在目的基因上游或下游连接一个报告基因。这样的重组DNA导入受体细胞后，可根据报告基因的表达产物筛选克隆子。常用的报告基因有：1）GUS（葡萄糖苷酸酶）基因；2）LUC（荧光素酶）基因；3）CAT（氯霉素乙酰基转移酶）基因；4）冠瘿碱合成酶基因；5）NPT—Ⅱ（新霉素磷酸转移酶Ⅱ）基因；6） PPT乙酰转移酶基因（PAT基因）。
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