| DNA的重组技术 | 点击： 作者：51protocol收集 来源： 时间： 2007-05-28 本站论坛
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DNA的重组技术
实验原理：质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。如果要克隆较小的DNA片段(＜10kb＝且结构简单,质粒要比其它任何载体都要好。在质粒载体上进行克隆,从原理上说是很简单的，先用限制性内切酶切割质粒DNA和目的DNA片段, 然后体外使两者相连接, 再用所得到重组质粒转化细菌,即可完成。但在实际工作中, 如何区分插入有外源DNA的重组质粒和无插入而自身环化的载体分子是较为困难的。通过调整连接反应中外源DNA片段和载体DNA的浓度比例,可以将载体的自身环化限制在一定程度之下,也可以进一步采取一些特殊的克隆策略,如载体去磷酸化等来最大限度的降低载体的自身环化,还可以利用遗传学手段如α互补现象等来鉴别重组子和非重组子。
外源DNA片段和质粒载体的连接反应策略有以下几种：
1、带有非互补突出端的片段 用两种不同的限制性内切酶进行消化可以产生带有非互补的粘性末端,这也是最容易克隆的DNA片段。
2、带有相同的粘性末端 用相同的酶或同尾酶处理可得到这样的末端。
3、带有平末端 是由产生平末端的限制酶或核酸外切酶消化产生，或由DNA聚合酶补平所致。由于平端的连接效率比粘性末端要低得多，故在其连接反应中，T4 DNA连接酶的浓度和外源DNA及载体DNA浓度均要高得多。通常还需加入低浓度的聚乙二醇(PEG 8000)以促进DNA分子凝聚成聚集体的物质以提高转化效率。
特殊情况下，外源DNA分子的末端与所用的载体末端无法相互匹配,则可以在线状质粒载体末端或外源DNA片段末端接上合适的接头(linker)或衔接头(adapter)使其匹配, 也可以有控制的使用E. coli DNA聚合酶Ⅰ的klenow大片段部分填平3’凹端,使不相匹配的末端转变为互补末端或转为平末端后再进行连接。
一、 材料 PUC，ΛDNA
二、 设备 恒温摇床， 台式高速离心机，
恒温水浴锅， 琼脂糖凝胶电泳装置，
电热恒温培养箱 ， 电泳仪无菌，
超净工作台， 微量移液枪，Tip. eppendorf管。
三、 试剂 10X bf T4 链接酶
琼脂糖 TAE
Marker EB
溴酚兰
四、 连接反应
五、电泳
实验原理: DNA重组技术是用内切酶分别将载体和外源DNA切开，经分离纯化后，用链接酶将其连接，构成新的DNA分子。限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。
5’…G↓AATTC…3’ →5’… G AATTC…3’
3’…CTTAA↑G …5’ →3’… CTTAA G…5’
构建DNA限制性内切酶图谱有许多方法。通常结合使用多种限制性内切酶，通过综合分析多种酶单切及不同组合的多种酶同时切所得到的限制性片段大小来确定各种酶的酶切位点及其相对位置。酶切图谱的使用价值依赖于它的准确性和精确程度。
限制性内切酶的一个活性单位U
理论上， 1hr,切1ug DNA 样品中所有专一位点的所用酶量实际反应，1U酶：能完全切割1ul λDNA的一个位点不能完全 切割1ug 带有4个酶切位点的样品和不纯的样品.
如果采用两种限制性内切酶,必须要注意分别提供各自的最适盐浓度。若两者可用同一缓冲液,则可同时水解。若需要不同的盐浓度,则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用,随后调节盐浓度,再用高盐浓度的限制性内切酶水解。
限制性内切酶的使用注意事项：
10x bf o 无盐
注意混匀 L 低盐
H 高盐
一.仪器
水浴锅(37℃，65℃) 凝胶电泳 灭菌锅 紫外检测 离心机
二.试剂及溶液
λ DNA Ecor I
pUC18 无菌水
终止液 (40%蔗糖) 70％，100％酒精
3Mol/L KAc(pH5.2) ice
琼脂糖 溴酚蓝
TE TAE
EB marker
三. 用品
移液器 20ul 一次性手套
tip 20ul 防护镜
离心管 0.5ml 吸水纸
胶带 浮子
PUC 18/19, λDNA
2人／组，一人做 PUC18 酶切 （20ug） Takara 25ug/个
一人作λDNA 酶切 （15ug）
EcoR1 1ul/人 （10 u） (20ul) Takara 4000u/个
四：酶切反应:
DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。大部分限制性内切酶不受RNA或单链DNA的影响。当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时,会影响其进一步使用,因此在吸取限制性内切酶时,每次都要用新的吸管头.
[注意]
1.酶切时所加的DNA溶液体积不能太大，否则DNA溶液中其他成分会干扰酶反应。
2、酶活力通常用酶单位（U）表示，酶单位的定义是：在最适反应条件下，1小时完全降解1mg λDNA的酶量为一个单位，但是许多实验制备的DNA不象λDNA那样易于降解，需适当增加酶的使用量。反应液中加入过量的酶是不合适的，除考虑成本外，酶液中的微量杂质可能干扰随后的反应。
3、市场销售的酶一般浓度很大，为节约起见，使用时可事先用酶反应缓冲液（1×）进行稀释。另外，酶通常保存在50%的甘油中，实验中，应将反应液中甘油浓度控制在1/10之下，否则，酶活性将受影响。
37℃,2hr
终止反应 65℃ 10min
各取2ul酶解液，电泳
EcoRI切割λDNA后电泳得到6个片段,
长度分别为 21.2, 7.4, 5.8, 5.6, 4.9 和 2.5kb
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