| 基礎分子生物學研究法 | | 点击： 作者：51protocol收集 来源： 时间： 2007-05-28 本站论坛 |
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基礎分子生物學研究法
一、生物運作的原則-Central Dogma
近代生命科學最大的成就莫過於對基因研究的突破。此中包括遺傳物質的確定、基因表達基本原則的認識、限制脢及相關酵素的發現與應用、質粒的發現與載體的發展，以及DNA定序和PCR等技術的發明等等。由於這些知識與技術的發展，我們突破了傳統遺傳學中「種(species)」的籓籬，能夠將特定基因從不同的生物來源分離出來，並且也能使它們無界限地在其它生物中表達。
我們了解，絕大多數的生物都是以DNA的形式來儲藏其遺傳信息。DNA分子能被複製(replication)，DNA中儲藏的遺傳信息可經由轉錄作用(transcription)錄製成RNA，mRNA可再經由轉譯作用(translation)翻譯成為蛋白質。這整套的基本運作原則稱為生物的中心教條(central dogma)。生物現象雖然是經由這些生物分子及其下游產物的統合作用來表達，但當我們要追究其個別功能和作用機制時就不能不上溯到基因層面了。研究基因的作用與調控時，我們常從分離與純化DNA著手，經過選殖與定序，最後放入適當的宿主中觀察。由於實驗技術的日見進步，其中有些步驟是可以跳過的。
二、DNA的分離與純化
DNA的萃取方式依材料的特性而有差別，在許多方法學書刊或雜誌中都有詳細的說明，我們在此不再一一詳述。通常我們在打破細胞後會用Tris-EDTA等中性緩衝液來處理DNA。Tris是緩衝劑，它的作用是避免pH值變化太大；EDTA是螯合劑(chelating agent)，它的作用是螯合緩衝液中可能殘餘的雙價金屬離子。鎂離子、鋅離子與鈣離子常是一些核酸脢及DNA水解脢的輔助因子(cofactor)；重金屬離子的存在會造成DNA磷酸二脂鍵斷裂。
在DNA的萃取過程中，我們通常用石碳酸-氯仿萃取法(phenol-chloroform extraction)除去蛋白質；以添加RNA水解脢來除去RNA。大分子DNA(染色體DNA)可用玻棒以繅絲的方式將其由水溶液及酒精的介面捲出純化；小分子DNA(如質粒、葉綠體或粒線體DNA)在傳統上均利用氯化銫浮力梯度(CsCl buoyant density)使用超高速離心機離心純化。由於純化技術的進步，近年來有許多親和性樹脂柱產生。它們是以色層分析純化方式取代超高速離心。這些方法節省了時間與金錢，純化效果是可接受的。
三、DNA的剪接
第二型限制脢(type II restriction enzymes)及DNA黏合脢(DNA ligase)的發現與應用對基因選殖具有關鍵性的影響，它們就像基因操作時的剪刀和漿糊一般。我們利用限制脢將特定的片段從大分子DNA上剪出，並以DNA黏合脢將它們塞入剪開的載體中來進行分子選殖的工作。
第二型限制脢是一群相當特殊的DNA內切脢(DNA endonucleases)，它們會辨認出DNA上的特定辨識序列(recognition sequences)。常用限制脢的辨識序列為雙股DNA上呈迴文結構(palindrome)的4~8個鹼基對。所謂迴文是指一個從正向或反向讀都是一樣的句子，但在這裡所指的是一段雙股DNA序列，你從其中一股的5’-端讀過去和從它對應股的5’-端讀回來是相同的。在有鎂離子的狀況下，限制脢在辨識序列內一定的地方以對稱的方式切斷DNA的磷酸二脂鍵，形成齊頭(blunt ends)或兩端各有一小段單股DNA的黏端(sticky ends)切點，切開的地方在5’-端留下磷酸基；在3’-端留下-OH基。有時我們會用鹼性磷酸脢(alkaline phosphatase)移除5’-端磷酸基或利用多核甘激脢(polynucleotide kinase)將磷酸基加入5’-端來控制基因選殖的操作。
常用的DNA黏合脢分為T4 DNA黏合脢(T4 DNA ligase)與大腸桿菌DNA黏合脢(E. coli DNA Ligase)兩種。T4 DNA黏合脢是噬菌體T4的基因產物，它是一個分子量約68,000的多胜鏈。在ATP與鎂離子的輔助下，它催化DNA末端5’-磷酸基和3’- OH基的結合。大腸桿菌DNA黏合脢的性質與T4 DNA黏合脢相似，不同處僅在：1.它以NAD而非ATP當輔助因子，2.在標準狀況下它只黏合具黏端的DNA片段。
四、細胞轉形(Transformation)
對基因選殖來說，所謂細胞轉形是將細胞外的裸露DNA(naked DNA)送到細胞內並使之產生應有的功能。細胞轉形不是一個新名詞。1928年Frederick Griffith就以肺炎雙球菌(Diplococcus pneumomiae)完成了這項實驗。不過話又說回來，Griffith是相當幸運的，因為革蘭氏陽性菌先天就多少具有被轉形的能力。如果當時換作革蘭氏陰性菌或其它物種，這項成就幾乎是不可能的。因為選殖及轉基因操作的需求，後來各式各樣的細胞轉形技術被發展出來。細胞轉形技術的發展方向不外乎以提高轉形率及便於操作為主。目前可用的轉形方法包括鈣休克法(calcium shock)、原生質體轉形法(protoplast transformation)、電導法(或稱電孔法，electroporation)、微注射法(microinjection)及使用基因槍(gene gun)。
鈣休克法是將細胞以含中等濃度的鈣離子溶液清洗後混入DNA，經加熱處理後篩選轉形株。多數細胞在生長至後對數期(late log phase)時經鈣處理後都能得到令人滿意的轉形率。這種方法很普遍地用於細菌及動物細胞。
原生質轉形法是將細菌或其它物種的細胞壁以酵素除去使之成為原生質體(protoplast)， 再混入DNA使原生質體轉形。在轉形過程中或加入一些如鈣離子及PEG(polyethylene glycol)等有利於細胞轉形的物質。轉形後的原生質體經過「復甦」(regeneration)，長出細胞壁後篩選轉形株。這種方法用於革蘭氏陽性菌、真菌及植物細胞轉形。
電導法是將DNA混入清洗過的細胞懸浮液中，用電導器以高壓電瞬間將DNA打入細胞中。通常混液中不含任何鹽類以免電流太強。這種方法很普遍地用於各種細胞轉形。
微注射法是將DNA溶液利用顯微技術直接注射入細胞中。這個技術目前僅用於動物細胞轉形。
基因槍法是將DNA固定在微顆粒(micro-particles)上，然後以氣壓將微顆粒射向目標細胞，藉由微顆粒的穿透使DNA進入細胞內。這個方法僅用於動、植物細胞的轉形。
有時因為實驗的需要或載體的限制，我們會用噬菌體DNA、病毒DNA或它們的衍生載體來轉形細胞。因為轉型的結果產生噬菌體、病毒或攜帶它們的細胞(carrier)，所以這種轉形特稱為轉染(transfection)，它在動物細胞的轉形是常見的。
至於轉基因植物(transgenic plants)常用的方法還包括農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的利用。農桿菌是一種植物病源菌，它的病源性與其巨型內生質粒有關。其內生質粒上的一段DNA會藉由農桿菌感染植物而被轉移到植物染色體內。因這段DNA含有的植物生長激素(auxin)基因和細胞分裂素(cytokinin)基因在植物細胞內失去控制而使植物產生冠狀瘤腫(crown gall)。這種引起瘤腫的質粒稱為引瘤質粒(Ti plasmid, tumor-inducing plasmid)，質粒上被轉移到植物染色體內的DNA片段稱為T-DNA。被選殖並經過修改過的T-DNA可在大腸桿菌中從事基因操作，再經由細胞轉形或結合生殖進入農桿菌，最後藉農桿菌的感染進入植物細胞中完成植物基因轉殖。
五、轉漬與偵測
當我們想知道兩段不同核酸之間的關係，我們常會利用到轉漬(blotting)與雜合(hybridization)等技術。轉漬是指將DNA、RNA或蛋白質轉印並固定在人工纖維膜上。雜合是利用DNA與DNA間或DNA與RNA間因鹼基配對而形成雜合體(hybrid)來確定兩者之間的關聯性。1975年生物學家Ed Southern將切成片段的DNA經由聚膠電泳分出大小後轉印在硝酸纖維膜上，並以放射性標示的DNA與之雜合開創了轉漬與雜合技術的先河。現在我們把聚膠電泳後的DNA固定在纖維膜上稱為南方轉漬(Southern blot)，把聚膠電泳後的RNA或蛋白質固定在纖維膜上稱為北方轉漬(Northern blot)或西方轉漬(Western blot)。
通常用來電泳分離DNA、RNA或蛋白質的聚膠可以是洋菜膠(agarose gel)、聚丙醯膠(polyacrylamide gel)或其它適合用於電泳的電中性膠體材料。轉漬操作中用來固定這些分子的纖維膜可以是硝酸纖維膜(nitrocellulose membrane)、中性或陽離子化的尼龍膜(nylon membrane)、PVDF (polyvinylidene fluoride)膜或其它適當的纖維膜。毛細轉漬法(capillary transfer)和電泳轉漬法(electric transfer)是轉漬過程中將聚膠中DNA、RNA或蛋白質橫向轉印到纖維膜上常用的兩種方式。毛細轉漬法是藉大量平板衛生紙的毛細力將膠體下方的緩衝液經由膠體和其上方的纖維膜向上吸，因此把DNA、RNA或蛋白質「沖」到纖維膜上。電泳轉漬法則是將膠體和纖維膜並列，橫向放在電泳槽中，藉由第二維電泳把這些大分子帶到纖維膜上。吸附在纖維膜上的大分子尚需經由烘烤、或紫外線照射、或乾燥來固定。
雜合時偵測用的短段DNA或RNA稱做探針(probe)，它們會與固定在纖維膜上的相關DNA或RNA片段因鹼基配對而結合。為了能監測探針的存在，這些DNA或RNA通常是放射性、彩色或螢光標示的。至於西方轉漬中固定在纖維膜上的蛋白質當然只能用標示過的抗體(antibody)或能與該蛋白質緊密結合的物質來偵測。
如果被偵測的物質純度很高或它們根本沒有分離的必要，你也不必大費周章地去跑電泳，你可以直接把它們滴在纖維膜或其它支撐物上固定。這種方式稱為墨點分析(dot analysis)。假使你滴點的技術很好的話，你可以把墨點不斷縮小，不斷縮小，不斷縮小……………，你終於知道生物晶片(biochip或microarray)是怎麼來的了吧？
相反的，如果我們把被偵測物放大，你也可以把這些技術用在整個染色體、整個細胞、整個組織切片或整個菌落上。於是原位雜合(in situ hybridization)和菌落雜合(colony hybridization)等名詞相繼出現。
六、DNA定序
如果我們選殖到一段有意義的DNA時，我們當然會想知道這段DNA的基本結構和它可能帶有的基因。解決這個問題最便捷的方式就是做DNA定序。DNA定序的方式有Maxam-Gilbert法和Sanger法兩種。這兩種定序法的基本原則是相類似的，它們都是使DNA鏈在A、T、C或G四種鹼基中的一種鹼基處逢機斷裂或終斷，然後以電泳分析出斷裂DNA片段的大小。當你已經知道每一種鹼基逢機斷裂或終斷時所造成的片段大小，你自然可依序排出這段DNA的鹼基序列。
Maxam-Gilbert法使用雙股DNA片段，首先以鹼性磷酸脢移除5’-端磷酸基，再以多核甘激脢將γ-32P-ATP的放射性磷酸基加進5’-端來標示DNA的末端。標示後的DNA以限制脢水解成大小不同的兩個片段，經電泳分離後定序。你也可以將被標示的DNA雙股分開，各別定序。定序過程中以化學方式逢機破壞特定的鹼基，使連接該鹼基的磷酸二脂鍵斷裂。因為被定序的DNA只有一端是以放射性磷酸基標示的，所以在放射顯影的膠片上你只可能看到從標示處到斷裂處的片段。依片段的大小你就能排出DNA序列。
Sanger法的主要是依據DNA複製原理，以單股DNA為模板加入DNA聚合脢及引子(primer)令其複製。在複製過程中加入特定鹼基的雙去氧三磷核干酸(dideoxynucleotide)，這些雙去氧三磷核干酸分子被DNA聚合脢逢機地連在正在製造中的DNA末端，使其末端的去氧核醣缺乏3’-OH基(該處是3’-H基)。製造中的DNA因缺乏3’-OH基而使DNA複製在該處自動終止。如果新製造的DNA鏈是螢光或放射性標示的，經過膠體電泳分出逢機終止片段的大小， DNA序列就能被排出。因為自動定序儀(autosequencer)的出現，現在做DNA定序已經不像以前那麼辛苦了。自動定序儀定序主要還是依照Sanger定序法的原理。
DNA定序或類似DNA定序法不僅只用於單純的定序，它也可以延伸到許多其它方面的研究。譬如說footprinting的主要研究對象是DNA附著蛋白質(DNA-binding protein)。我們把適量的DNA附著蛋白質加入標示過的DNA溶液中使之附著於DNA上，將蛋白質-DNA複合物(protein-DNA complex)用DNA水解脢做部分水解(partial digestion)後做電泳分析。放射顯影膠片上空白的DNA區域就是被蛋白質附著而無法被水解脢接觸到的序列。
七、聚合脢鏈反應、反轉錄和反轉錄-聚合脢鏈反應
聚合脢鏈反應(PCR，polymerase chain reaction)是1980年中期以後發展出來的重要技術，它主要是綜合了DNA複製原理與DNA加熱變性(denaturation)與降溫回復(renaturation)的特性。Denaturation意指造成鹼基配對的氫鍵被破壞而使DNA的雙鏈分開成為兩個單鏈；renaturation意指造成鹼基配對的氫鍵再形成而使兩個分開的單鏈DNA回復為雙鏈。進行聚合脢鏈反應時我們同時加入模板DNA、雙向的複製引子、去氧三磷核干酸(dNTP)及耐熱性DNA聚合脢。聚合脢鏈反應的每一個循環包括：加熱(如94oC)使DNA雙鏈分開成單鏈，降溫(如54oC)讓複製引子與單鏈模板DNA形成配對，再升溫(如72oC)使DNA聚合脢開始聚合作用。在不斷地重複循環的過程中，夾在一對複製引子之間的DNA片段就被重複製造。到最後模板上的這一部份DNA被單獨地擴增了幾十億到幾百億倍(2N，N=循環次數)。聚合脢鏈反應給了我們「大海撈針」的可能性，也節省了我們選殖特定基因的時間。你甚至可以連DNA分離與純化都省了，乾脆弄一些亂七八糟的髒水或泥巴來，經過初步處理後就PCR一番，看看能不能分離到你的夢幻基因。不過，聚合脢鏈反應也有其侷限性。如果你要分離一個「前無古人」的基因，你就沒有現成的DNA序列可以參考，複製引子也無從做起。老老實實地從頭開始選殖吧！又如果你要分離的基因的DNA序列亂度很大，複製引子的設計是要相當費腦筋的！聚合脢鏈反應也有許多另類的應用，其中包括多型性DNA逢機增幅(RAPD， random amplification of polymorphic DNA)，這個技術對物種親緣研究和種源鑑定是很有用的。
真核生物的基因選殖和原核生物有所不同，因為絕大多數的真核基因是不連續基因，有外顯子(exons)與內顯子之分(introns)。真核mRNA的轉錄是先把外顯子與內顯子呈一條線地一齊唸出來，然後經過核醣核酸剪接(RNA splicing)的過程把內顯子切除使外顯子連續地連在一起，所以成熟的真核RNA或由它們轉譯出來的蛋白質和DNA上所呈現的序列有很大的差異。直接選殖的真核DNA在別種生物中進行基因表達時會出現很大的問題。為了解決這個問題，我們利用了反轉錄技術(RT，reverse transcription)。顧名思義，反轉錄與轉錄是反向生化反應，它是利用反轉錄病毒(retrovirus)的反轉錄脢(reverse transcriptase)將RNA反轉錄成DNA。被反轉錄出的DNA稱做cDNA(complementary DNA)，將cDNA複製成雙股後就能直接選殖。
將萃取到的大量混合真核mRNA一齊做成cDNA，再不分你我地選殖成一鍋混合選殖株留待撈取特定的目標株是真核基因選殖者想做和常做的事。這一鍋混合選殖株就稱為cDNA庫(cDNA library)。反轉錄技術對以16S rRNA(或18S rRNA)研判生物親緣關係的研究也很重要。
如果把反轉錄技術和上述的聚合脢鏈反應技術合併運用那就成了反轉錄-聚合脢鏈反應技術(RT-PCR)。以RNA為原始的材料，它像聚合脢鏈反應一樣能使你得到大量夢想中的基因。這個技術對於選殖真核生物的特定基因或選殖以RNA為遺傳物質者的基因非常重要。
八、轉基因生物
有了以上的知識和技術再加上一些想像力和市場概念，看來我們就可以製造一些轉基因生物(TGO，transgenic organism)。不過，一切操作都得按照轉基因生物安全規則來。更重要的是：如果你要製造轉基因微生物，你要注意其安全性；如果你要製造轉基因植物，你也要注意安全性；如果你要製造轉基因動物，你不但要注意安全性還要考慮道德性。你想要賣轉基因生物產品或加工品別忘了標明清楚，以免吃官司！對於這個世界上的「新生事物」有的人是樂觀的，有的人是悲觀的。你呢？
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