Gel filtration装填的基本原理-试验方案

Gel filtration装填的基本原理
点击： 作者： 来源： 日期：2007-04-10 本站论坛

Gel filtration的基本原理，现在谈谈我装柱子的过程。我们用的是Amersham 的 XK26/40的空柱子，然后往里面填充Sephacryl S-300 HR 的resin。按道理说，要提高分辨率，柱子应该是越长越细才好，这种柱子虽然不短，但是挺粗的。但是一个好处就是，样品体积可以大一些。
　　装柱子本身就是一件很tricky的事情，以至与这课的教程上专门列了一小节来解释怎么装柱子。我们这一组人中，我负责装柱子。一开始就是洗resin了，用粗制烧结玻板过滤的漏斗来洗，感觉这方法还挺快的。洗完了，就把resin重悬成50%的slurry，然后就是往柱子里头倒了。但是呢，有一个小窍门，就是必须先封闭柱子的下出口，往柱子里面倒10%体积的buffer。我过去装柱子犯傻，不知道要这么做，结果发现下面的resin 不均匀不说，还有一大堆气泡。所以先加buffer是很必要的。倒slurry的时候还得用玻棒引流，这样可以尽可能的避免气泡。然后就是等了，等resin 沉降３０分钟后，就可以打开柱子的下出液口，让多余的缓冲液流出去。液面低到靠近柱面的时候呢，就可以把上端液流接头接到柱子上方。这个过程最麻烦了，主要是不能引入气泡，所以先得让这个接头装置里面充满缓冲夜，把气泡赶出来。我第一次做没经验，费了九牛二虎之力才搞定了。然后就是接上蠕动泵(peristaltic pump) 加压，让resin继续紧缩一下。随着柱面的下降，接头装置还得不断往下移动，使得接头刚刚好与柱面接触。接触不紧密的话，等于是冲淡了样品，分辨率会降低。
　　柱子装好了，但还不能开始跑样品。为什么呢？因为这种柱子的质量必须很好才能起到分离蛋白的效果，否则是根本没法work的。所以呢，首先得测试这个柱子是否真的装好了。测试过程很简单，就是跑一下蓝色葡聚糖(blue dextran)，蓝色葡聚糖是带有蓝色染料的多糖高分子聚合体，体积非常大，所以在空体积(void volume)就会洗脱出来。跑蓝色葡聚糖可以起到三个目的。第一个就是确定void volume，知道这个空体积是很重要的。因为每次装柱子，实际resin的总体积都会有微小的不同。特定蛋白在柱子的洗脱体积与空体积的比值是一定的，所以只要知道了空体积，就能知道蛋白大概会在什么时候洗脱出来。第二个就是确定样品会被稀释多少。第三个呢，是柱子是否装的均匀。如果装的不均匀，葡聚糖j就会跑得形状怪异。一般来说呢，柱子下端堆积会比上端均匀，为了分辨度好，应该从更均匀的一端上样。所以我们在做的时候，是从下端上样的。
　　忙活了半天，当所有装置都装好的时候，感觉还是挺兴奋的。首先是蠕动泵，然后是柱子，然后是UV monitor加记录仪。整套装置不贵，功能却很齐全。

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