利用聚合酶链反应制备放射性标记的DNA探针
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4.      从热循环仪中取出反应管,用微量移液器尽可能地从反应液上层吸去矿物油。用50μl氯仿抽提反应液,以除去剩余的矿物油。室温下离心1 min以使液相与有机相分离。

5.      吸去上层水相,转移到一个清洁的微量管中,加入载体tRNA(10~100μg)或糖原(5μg),用等体积的4mol/L乙酸胺和2.5体积的乙醇沉淀DNA,放置于-20℃ 1~2 h或-70℃ 10~20 min。4℃下以最大速度离心5~10 min收集沉淀的DNA。

6.      将DNA溶于20μl TE(pH 7.6), 用Sephadex G-75离心柱层析除去残存未掺入的dNTP和寡核苷酸引物。

7.      用液体闪烁计数仪测定1.0μl离心柱外水体积的放射活性。贮存剩余的放射性标记DNA于-20℃以备用。

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利用聚合酶链反应制备放射性标记的DNA探针

点击:   作者:   来源:  时间: 2006-11-09  本站论坛
  利用聚合酶链反应制备放射性标记的DNA探针

1.      在一个0.5 ml的薄壁微量离心管中设置下列扩增/放射性标记反应体系:

10×扩增缓冲液               5.0μl

10 mmol/L dNTP溶液          1.0μl

0.1 mmol/L dCTP              1.0μl

20μmol/L 正向寡核苷酸引物   2.5μl

20μM反向寡核苷酸引物        2.5μl

模板DNA(2~10 ng或约1 fmol)   5~10μl

10 mCi/ml[α-32P] dCTP (比活性3000 Ci/mmol)        5.0μl

水                            加至48μl

在反应体系中加入2.5单位耐热DNA聚合酶。轻敲管壁以混合各组分。

2.      如果热循环仪无加热盖,可加一滴(50μl)轻矿物油或一粒石蜡于反应混合物之上,以防止样品在反复加热及冷却的循环中蒸发。将微量管放入热循环仪。

3.      通过变性、复性和聚合扩增样品,反应时间见下表。

循环数

变性

复性

聚合

30个循环

94℃ 30~45s

55~60℃ 30~45s

72℃ 1~2 min

最后一个循环

94℃ 1 min

55℃ 30s

72℃ 1 min

 
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