酶联免疫吸附法在饲料安全检测中的应用-试验方案

酶联免疫吸附法在饲料安全检测中的应用
点击： 作者： 来源： 日期：2006-11-09 本站论坛

酶联免疫吸附法（enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA）是免疫酶一种，是一项先进的免疫化学测定技术。因其具有特异性高、敏感性强、结果易于检测，是饲料安全检测中某些违禁药品和添加剂，有害微生物的筛检和毒素的检测，是饲料安全检测中一项新的检测技术。 1 ELISA 的基本原理及方法类型 1.1 基本原理 EILSA主要是基于抗原或抗体能吸附至固相载体的表面并保持其免疫活性，抗原或抗体与酶形成的酶结合物仍保持其免疫活性和酶催化活性的基本原理。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应，用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其它物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量有一定的比例，加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。 1.2方法类型 ELISA 既可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂和五种常见的检测方法。 1.2.l 三个必要的试剂固相的抗原或抗体；酶标记的抗原或抗体；酶反应的底物。五种常见的检测方法根据试剂的来源和样品的性状及检测的具体条件，可分为：双抗体夹心法，主要用于检测抗原；间接法，主要用于检测抗体；竞争法，既可用于检测抗原又可用于检测抗体；双抗原夹心法，用已知抗原检测未知抗体；中和法，检测抗体。 2 ELISA在饲料安全检测中的应用饲料安全检测需要在各种各样复杂基质的检样中对含量非常低的有毒害物质进行检测、定量和鉴定，由于饲料产品本身具有的附加值低，流通快，数量大的特点，因此利用快速、便捷、价廉、准确的检测手段进行饲料安全检测极为重要。目前在饲料安全检测中通常采用初筛（提供某种有害物质是否存在的初步信息）——检测（即进行分离和定量分析）——确认分析（对有疑问的有害物质提供明确的鉴定）程序来监测饲料中的有毒有害物质。ELISA因其具有的比传统的检测方法灵敏度高、易于使用、较低的设备费用、快速等优点，已越来越广泛地应用于饲料中违禁药品和添加剂的初筛，毒素的测定，和有害微生物的快速筛检。 2.1 EllSA用于饲料中违禁药物和添加剂的初筛2001年12月21日国家质量监督检验检疫总局推荐英国Randox公司生产的ELISA试剂盒为我国检测动物激素和抗生素残留的首选筛选试剂。目前用于饲料中违禁药品和添加剂筛检的商品化试剂盒有许多，例如德国r-Biopharm公司，意大利Tecna及美国Idexx公司的产品等，它们在饲料安全检测中发挥着重要的作用。本文仅以ELISA试剂盒筛检盐酸克伦特罗为例做一介绍。盐酸克伦特罗简称克伦特罗（CL），因其对人类健康的极大危害，被严格禁止在饲料中添加。目前ELISA试剂盒已广泛用于饲料中克伦特罗的初筛。其基本原理是抗原体反应。即利用样品中的克伦特罗能与酶偶联克伦特罗竞争性地与固相上已包被的克伦特罗结合。其基本步骤首先将克伦特罗抗体加入已包被克伦特罗抗体（羊抗兔IgG）的微孔板内，经过孵育和洗涤，加入克伦特罗酶标记物和待测样品，样品中的克伦特罗与克伦特罗酶标记物竞争克伦特罗抗体，洗涤除去没有连接的克伦特罗酶标记物，将酶基质和发色剂加入到孔中并孵育，结合的酶标记物将无色的发色剂转为蓝色的产物，再加入反应停止液后，使颜色由蓝转变为黄色，在450mm处测量，吸光度与样品中盐酸克伦特罗的浓度成反比。 2.2 ELISA用于饲料中毒素的测定饲料中的毒素主要是由真菌产生的，主要包括黄曲霉毒素，简曲霉毒素等。运用ELISA能测定饲料中霉菌毒素的含量。以测定黄曲霉毒素为例，黄曲霉毒素是一组化学结构类似的化合物，目前已分离鉴定出12种。在我国饲料标准中黄曲霉毒素的含量通常以黄曲酶毒素B₁计，本文仅介绍竞争性ELISA间接法检测黄曲霉毒素B₁。目前ELISA试剂盒也广泛用于饲料中黄曲霉毒素B₁的测定。B₁抗原能与黄曲霉毒素B₁与载体蛋白的复合物竞争抗黄曲霉毒素B₁的特异性单克隆抗体，在固相载体表面形成抗原抗体复合物、复合物再与现标记的第二抗体结合，在酶的作用下，底物发生降解而产生有色物质，通过酶标仪测定而计算出样品中黄曲霉毒素B₁的含量。其基本步骤首先用包被抗原包被酶标微孔板，洗涤去除未包被抗原，在微孔内加入系列标准黄曲霉毒素B1溶液（制作标准曲线）或样品提取液，再加人稀释抗体，孵育，洗涤，在微孔内加入酶标二抗，孵育，洗涤，微孔内加入酶底物溶液，孵育，加中止液中止反应，测量、计算出样品中黄曲霉毒素B₁浓度。 2.3 ELISA用于饲料中有害微生物的快速筛检饲料中常含有许多有害微生物，这些有害微生物不仅降低饲料品质，影响畜禽的健康，同时作为一种内源性污染，通过畜产品危及人类。目前饲料安全检测中对饲料中有害微生物的控制主要是监测饲料中沙门氏菌。传统的沙门氏菌检测方法程序复杂，所用试剂繁杂、检测周期长达七天，远远不能适应要求。目前已有许多ELISA试剂盒能方便、快速地筛检出饲料中沙门氏菌的阳性样品。据有关文献报道，对一些食品（包括自然污染了沙门氏菌和为了对比人为加入少量沙门氏菌（0.04－0.2cfu／mL肠炎沙门氏菌）的食品用Salmonella-Tek试剂盒进行检测的结果与用常规培养方法进行检测的结果进行比较，两种结果具有完全的一致性。但由于沙门氏菌与某些菌株之间存在相同的抗原，因此ELISA都是用于沙门氏菌的筛检，而非确证试验。用ELISA筛检沙门氏菌，根据其采用抗体分为多克隆酶和单克隆酶免疫分析筛选方法。其基本原理是利用与沙门氏菌抗原具有高特异性的单克隆（或多克隆）抗体来检测沙门氏菌。其基本步骤是首先在包被有抗沙门氏菌的单克隆抗体（或吸附有沙门氏菌多克隆抗体）的微孔内加入经过前增菌和选择性增菌的待检样品，样品中如有沙门氏菌抗原存在，与孔内的特异性抗体结合形成抗原抗体复合物，洗涤去掉小孔内其它物质，加入接合剂，接合剂与抗原抗体结合物中的抗原结合，洗涤去掉未结合的接合剂，加入酶底物，沙门氏菌抗原显色，再用终止液中止反应，测定光密度值，当光密度值大于或等于临界值时，即可推定为阳性。 3 ELISA社驻的条件实求由于ELISA检测范围在ng至Pg水平，属于超微量分析技术，因此对试剂、物料及实验各步骤的反应条件和操作都有严格的要求。 3.1 试剂和物料的条件要求 ELISA试验所需的试剂分为主体试剂和辅助性试剂。通常采用的ELISA商品试剂盒中已包括了足够进行96个测量的主体试剂和物料，如已包被抗体的微孔板、标准液、酶标记物浓缩液、抗体浓缩液、酶基质、发色剂、停止液等。在使用时须严格按照使用说明书进行，一次检验必须使用同一批号试剂盒内的试剂，不能使用超过有效期的试剂（物料）。对于未使用完的试剂和微孔板，必须于2℃～8℃密封保存。不能重复使用微量孔。对于加缓冲液、洗涤剂、样本稀释液等辅助性试剂的制备，应最好在临用时配制。蒸馏水的质量至关重要，不合格的蒸馏水能使空白值升高，必须使用新鲜的双蒸馏水来制备试剂。 3.2 操作步骤的条件要求开始试验前应将试剂盒和待测样品回至室温20℃－25℃，每一样品及试剂均使用单独的吸嘴以免交叉污染。在加样时应力求准确，将样品加入孔底，不可出现气泡。在孵育培养时，由ELISA试验一般都有二次抗原抗体反应，应注意使各ELISA条板的温度迅速平衡，当室温高于20℃，可将ELISA板避光放在实验台上以便不时观测。在洗涤时应特别仔细，虽然洗涤在ELISA度试验中不是一个反应步骤，但却决定着试验的成败，洗涤的目的是洗去反应液中没有与固相抗原（体）相结合的物质，以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质，如洗涤不彻底，特别是最后一次如有酶结合物的非特异性吸附存在，将使空白值升高。