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荧光原位杂交（FISH）和用引物介导的原位标记（PRINS）操作规程

点击： 作者： 来源： 时间： 2006-11-09 　本站论坛

仪器设备
    1、医用微波炉；
     2、水浴锅；
     3、 OLYMPUS BX51荧光显微镜；
     4、 OLYMPUS DP11数字显微照相机。

FISH试剂
    （1）1×PBS：由10×PBS溶液稀释而成，储存于4℃；
     （2）20×SSC（pH7.0）；
     （3）2×SSC，由20×SSC溶液稀释而成；
     （4）25mg/ml蛋白酶K消化液。
     （5）变性液(70％甲酰胺+2×SSC，pH7.0)：4ml 20×SSC；8ml蒸馏水；28ml甲酰胺。每次新鲜配制。
     （6）杂交后洗涤液： 20×SSC 4ml；蒸馏水16ml；甲酰胺20ml。每次新鲜配制。调节pH前升至室温。

实验步骤
    1、脱蜡：
     1）二甲苯脱蜡3次，每次5min；
     2）100％酒精两次，每次2min；
     3）移出酒精，斜置切片，标记末段向下，空气干燥。
    2、蛋白酶处理:
     1）每个染色缸40ml蛋白酶K消化溶液，配制方法如下：2×SSC 40ml倒人Facal管，在水浴槽中预热。将消化酶液加入管内，摇动直到酶溶解。
     2） 37℃水浴槽中预热染色缸和蛋白酶K溶液。37℃孵育20min。
     3） ×SSC在室温下漂洗切片3次，每次1min。
     4）梯度酒精脱水（-20℃预冷）。
    3、变性：
     1）每一个立式染色缸配制40ml变性溶液；
     2）78℃水浴槽中平衡预热混合液染色缸；
     3）78℃孵育8min；
     4）即移入-20℃预冷70%酒精的染色缸内2min，再依次移入80%、90%和100%的-20℃预冷酒精内，每缸2min；
     5）空气干燥。
    4、杂交：
     1）准备探针；
     2）取一个较大的湿盒，交叉放置切片；
     3）滴10μl探针在切片的组织上，加盖玻片；
     4）盖上湿盒盖，37℃孵育12h～16h。
     杂交后的水洗：
     5）镊子小心去除盖玻片；
     6）43℃预热杂交后水洗溶液40ml水洗切片15min；
     7）2×SSC(37℃)洗两次，每次10min；
     8）切片放人染色缸的1×PBS内待检测，勿使切片干燥。
     检测：
     9）从1×PBS中取出切片，除去过多的水分，避免标本干燥。把切片放入湿盒内，同时处理4张切片。
     10）每张切片使用30μl～60μl罗丹明抗-地高辛抗体或FITC卵白素，室温下孵育20min；
     11）去掉塑料盖膜，把切片放入含1×PBS的染色缸。1×PBS室温下洗3次，每次2min。
扩增：
     12）从1×PBS中取出切片，斜置切片使液体排出；
     13）每张切片滴30μl～60μl抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min；
     14）去掉塑料盖膜，把切片放人含1×PBS的染色缸。1×PBS室温下洗3次，每次2min；
     15）从1×PBS中取出切片，斜置切片使液体排出；
     16）每张切片滴30μl～60μl抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min；
     17）1×PBS室温下洗3次，每次2min。
    5、细胞核染色：
     1）张切片加10μl～20μl DAPI，覆盖盖玻片并在室温下孵育2～5ml；
     2）尽可能快的在荧光显微镜下观察或封闭盒内保存在-20℃冰箱。切片在染色之后1h内可以在显微镜下观察。

PRINS步骤
    1、常规脱蜡浸入0.01mol/LPBS；
    2、用0.2mol/L盐酸处理5min；
    3、蛋白酶K(25μg/m1)消化37℃ 15min；
    4、分别用80％，95％和100％酒精脱水，室温干片；
    5、加PCR混合液25μL(10mmol/L Tris-HCl，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2，各加200μmol/L dATP，dCTP，dGTP，1.5mmol/L dig-11-dUTP l.5μl，引物250ng，Taq DNA聚合酶2U)，加盖片；
    6、94℃变性5min后置入65℃湿盒中5min；
    7、用0.1×SSC液，65℃洗5min；
    8、片于65℃ 10s～20s；用4×SSC-0.1％吐温20液42℃洗5min，2次；
    9、经Buffer I液洗后滴加20％羊血清封闭30min；
    10、加地高辛抗体复合物(1:500)室温下2h；
    11、BufferⅢ液洗5min；
    12、用BCIP-NBT显色1h～2h，在镜下控制，终止显色；
    13、用中性红或核固红衬染，酒精脱水，二甲苯透明，树脂封片。