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甲醇酵母基因表达系统是一种最近发展迅速的外源蛋白质生产系统。甲醇酵母是可利用甲醇作为唯一碳源的酵母，主要有H.Polymorpha、Candida Bodinii、Pichia Pastoris三种，其中Pichia Pastoris作为基因表达系统使用得最多、最广泛［1］。与以往的基因表达系统相比，它具有无可匹敌的高表达特性，已被认为是最具有发展前景的生产蛋白质的工具之一。
1. 外源蛋白质的基因在甲醇酵母中的高效表达
目前已有多种蛋白质的基因在该表达系统中克隆成功，包括蛋白酶、酶抑制剂、受体、单链抗体等(表1)。尽管各种外源蛋白质产生的水平不一，但各种蛋白质在甲醇酵母中的产生水平均为在细菌、昆虫或哺乳动物等表达系统中产量的10～100倍［2］。如表皮生长因子(EGF)在酿酒酵母中的产量为7.4mg/L，而在甲醇酵母中为450mg/L，提高了60倍［3］。椐报道，外源蛋白质在甲醇酵母中的产量最高可达12g/L［9］。
表1 外源蛋白质在甲醇酵母中的高效产生
| 外源蛋白质 |
产生量(g/L) |
文献 |
| 转化酶 |
2.3 |
［4］ |
| D-丙氨酸羧肽酶 |
0.8 |
［5］ |
| α-淀粉酶 |
2.5 |
［6］ |
| Kunitz蛋白酶抑制剂(AbPP) |
1.0 |
［7］ |
| 瞬时抗凝蛋白(TAP) |
1.7 |
［8］ |
| 破伤风毒素片段C |
12.0 |
［9］ |
| 百日咳抗原P69 |
3.0 |
［10］ |
| 人免疫缺陷病毒1膜外糖蛋白gp120 |
1.3 |
［11］ |
| 肿瘤坏死因子(TNF) |
10.0 |
［12］ |
| 人转铁蛋白N端 |
4.0 |
［13］ |
2. 实现外源蛋白质高效产生的关键因素
2.1 表达载体 首先，甲醇酵母中没有稳定的质粒，所以其表达载体采用整合型质粒。利用醇氧化酶(甲醇代谢的关键酶)基因-1(AOX1)的启动子(PAOX1)和转录终止子(3′AOX1)构建成整合型表达载体。PAOX1是一个极强的启动子，醇氧化酶的产量最高可占甲醇酵母中可溶性蛋白质的30%［2］，所以能使外源蛋白质在它的控制下高效产生。其次，在载体中加入酿酒酵母的分泌信号和前导肽序列(α因子)构建分泌型载体，一方面可以减轻宿主细胞的代谢负荷，另一方面可以减少宿主细胞蛋白水解酶对外源蛋白质的降解，pPIC9K、pMETαA、B、C均为此类载体。此外，使多拷贝目的基因整合入甲醇酵母染色体，形成多个表达单元，产生高产的菌株，此类载体有pAO815、pPIC3.5、pPIC9等。
2.2 受体菌 在以葡萄糖或甘油为碳源的培养基上生长时，甲醇酵母中AOX1基因的表达受到抑制，而在以甲醇为唯一碳源时，诱导基因表达，使外源蛋白质的产量更高。甲醇酵母适合高密度连续培养的条件，细胞干重达100g/L以上，蛋白质产量极高［14］。受体菌采用蛋白水解酶缺陷型，从而大大降低产物的降解。常用的甲醇酵母受体菌有GS115、KM71、PMAD11、PMAD16等。
3. 应用前景
经过近几年的发展完善，甲醇酵母表达系统已日趋成熟，应用也日趋广泛。国内已有多篇在甲醇酵母中生产外源蛋白质成功的报道(表2)。美国Invitrogen公司也已开发出多种新型的甲醇酵母表达系统试剂盒，如Multi-copy Pichia Expression Kit、Easyselect Pichia Expression Kit、Pichia methanolia Expression System等，利用甲醇酵母表达系统克隆一个外源基因已十分方便。相信随着对甲醇酵母研究的进一步深入，它在生产外源蛋白质方面将日益展示出诱人的前景。
表2 国内利用甲醇酵母产生的外源蛋白质
| 外源蛋白质 |
产生量(g/L) |
文献 |
| 人胰岛素 |
0.25 |
［15］ |
| 人胰岛素原 |
0.3 |
［16］ |
| 人p53蛋白 |
0.2 |
［17］ |
| 辣根过氧化物酶 |
4～6 |
［18］ |
| 人基质金属蛋白酶-9 |
0.01 |
［19］ |
参考文献
［1］李黄金等. 《生物工程学报》，1998，14(4)：337
［2］戴秀玉. 《微生物学报》，1997，37(6)：483--485
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［4］Tschopp JF. Bio/Technology，1987，5：1305-1308
［5］Despreaux CW et al. Gene，1993，131：35--41
［6］Paifer E et al. Yeast，1994，10：1415--1419
［7］Wagner SL et al. Biochem Biophys Res Commun，1992，186：1138--1145
［8］Laroche Y et al. Bio/Technology，1994，12：1119--1124
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［12］Sreekrishna K et al. Biochemistry，1989，28：4117--4125
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［16］郭永志等.《生物工程进展》，1999，19(6)：64
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［19］颜红春等.《中国生物化学与分子生物学学报》，2000，16(2)：194
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