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质粒DNA的提取与纯化

点击： 作者： 来源： 时间： 2006-11-09 　本站论坛

1 质粒DNA的提取
质粒DNA是细菌细胞中小的共价闭合环状双链DNA。由于基因工程中使用的载体主要是质粒，因此，质粒DNA的提取和纯化是进行基因工程的重要前提。提取质粒DNA的方法很多，下面介绍几种有代表性的程序。
1)酚提取法
2)碱提取法其基本原理是在溶菌酶和SDS破壁释放DNA后，在强碱条件下，DNA变性成单链，当加醋酸钠(NaAc)适当中和pH时，质粒DNA复性；而Ch-DNA和大分子RNA仍为单链并与蛋白质-SDS复合物被高盐沉淀，质粒DNA留在溶液中。不需经酚氯仿抽提，即可直接用乙醇沉淀上请中的p-DNA)。
3)煮沸提取法此法快速简便，既可小规模检验也可大规模制备质粒DNA。其基本原理是在溶菌酶和Triton破壁释放DNA后，迅速煮沸，使Ch-DNA和蛋白质沉淀，质粒DNA留在溶液中。
2 质粒DNA的纯化(PCR产物的纯化)
(1)加入0.1倍体积的10×STE缓冲液
⑵ 加入等体积的4 mol/L NH4Ac
⑶ 加入2.5倍体积室温放置的无水乙醇
⑷ 立即在室温下12 000r/min, 离心10 min，使DNA沉淀，小心地去掉上清
⑸ 加入200μl的70%（V/V）乙醇
⑹ 室温下12 000r/min, 离心10 min，小心地去掉上清，干燥
⑺ 用与原样品体积相等（或减小体积以使样品浓缩）的TE缓冲液重悬DNA，放置4℃待用, 或-20℃贮存。

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