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  • cDNA第二链的合成

  • 点击：    作者：   来源： 日期：2006-11-09    本站论坛
1)离心沉淀cDNA第一链，并重悬在50μl水中，加50μl 2×第二链缓冲液(0.2mol／L Hepes，pH6.9，20m mol／L MgCl2，5 m mol／L DTT，0.14 mol／L KCl，1 m mol／L 4种Dntp)，混合均匀。
2)每微克底物加大肠杆菌DNA聚合酶K1enow片段20～50单位，15℃反应20小时，此酶能识别cDNA 3’末端发卡环，并以其为引物，cDNA第一链为模板，开始第二链的合成。
3)加0.5 mol／L EDTA 2μl终止反应。取样电泳，以提取第一链同样的方法分离沉淀dsDNA。
 对于这样合成的dsDNA不是全长的DNA分子，所以，需要进一步用逆转录酶合成。
4)溶解上述dsDNA在20μl水中，再加入：1mol／L Tris.HCl pH8.3)5μl，1 mol／L KCl 7μl,250m mol／L MgCl2 2μl，20m mol／L 4种‘dNTP各2.5μl,700m mol／L β-MCE 2μl，加重煎水到48μl，加逆转录酶2μl (40单位)、42℃保温反应1小时。
5)加0.5 mol／L EDTA 2μl终止反应，取样电泳，以同样方法抽提，分离沉淀dsDNA。
6)用两次合成的双链cDNA和单链cDNA在1.4％碱性琼脂糖凝胶上电泳，放射自显影后观察，如果dsDNA片段的长度是第一链cDNA的两倍，那么，合成便是成功的。
7)用核酸酶S1消化dsDNA，除去连接两条链的发卡环。

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