组织DNA的制备-试验方案

组织DNA的制备
点击： 作者： 来源： 日期：2006-11-09 本站论坛

　　（1）将200mg组织在冰浴条件下用消毒剪刀充分剪碎，加4ml 1×RSB缓冲液（10mmol/L Tris, pH7.4;10mmol/l NaCl;25mmol/L EDTA,pH7.4）放入10ml带盖的塑料管中。
　　（2）加SDS至浓度为1%（可加0.4ml10%SDS），混匀。由于DNA从核中释放出来，样品变得粘稠。
　　（3）加10mg/ml蛋白酶k 44μl，终浓度为100μl/ml，37℃保温1～3d，直到组织完全解体。中间可振动样品管几次。加0.4ml 5mol/L NaCl。
　　（4）用等体积饱和酚、1/2体积饱和酚和1/2体积氯仿-异戊醇及等体积氯仿-异戊醇（24：1）各抽提一次，3000rpm离心5min，用大口钝缘吸管小心吸取上层水相。
　　（5）加2.5倍体积预冷无水乙醇沉淀DNA。用一玻璃棒收集白色纤维丝状的大片段DNA，并移入一新管，吸干DNA中的无水乙醇。
　　（6）DNA溶于4ml 0.1×SSC中，4℃过夜可作进一步纯化。
　　（7）加20μl RNase A(10mg/ml),37 ℃保温5h。加0.4ml 5mol/L NaCl。
　　（8）同上法用饱和酚、氯仿-异戊醇抽提，乙醇沉淀离心，弃上清。
　　（9）75%乙醇洗涤2次，离心，弃上清，真空抽干。适量1×TE溶解，保存在4℃。