| RAPD操作要点 | | 点击： 作者： 来源： 时间： 2006-11-09 本站论坛 |
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一、 材料
不同来源的DNA(50ng/ul)。
二、设备
PCR仪，PCR管或硅化的0.5ml eppendorf管，电泳装置。
三、试剂
1、随机引物(10mer) (5umol/L)：购买成品。
2、Taq酶：购买成品。
3、10xPCR 缓冲液：配方见第八章。
4、MgCl2 ：25mmol/L。
5、dNTP：每种2.5mmol/L。
四、操作步骤：
1. 在25ul反应体系中,加入
模板DNA 1ul (50ng)
随机引物 1ul (约5pmol)
10xPCR Buffer 2.5ul
MgCl2 2ul
dNTP 2ul
Taq酶 1单位（U）
加ddH2O 至 25ul
混匀稍离心, 加一滴矿物油。
2. 在加热至90℃以上的PCR仪中预变性94℃ 2分钟, 然后循环: 94℃ 1分钟， 36℃ 1分钟， 72℃ 1分钟，共40轮循环。
3. 循环结束后, 72℃ 10分钟，4℃保存。
4. 取PCR产物15ul加3ul上样缓冲液(6x)于2% 琼脂糖胶上电泳, 稳压50-100Ｖ（电压低带型整齐， 分辨率高）。
5. 电泳结束，观察、拍照。
[注意] 1、电泳时一般RAPD带有5-15条, 大小0.1-2.0kb。
2、 特异性的DNA带可以克隆作为一个新的分子标记应用。
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