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位点特异性重组

点击： 作者： 来源： 时间： 2006-11-07 　本站论坛

位点特异性重组　　我们可以看到，同源重组一般都在染色体内仍按DNA序列的原来排列次序。但是在所谓位点特异性重组（site-specific recombination）中，DNA节段的相对位置发生了移动，从而得到不同的结果─DNA序列发生重排。位点特异性重组不依赖于DNA顺序的同源性（虽然亦可有很短的同源序列），而依赖于能与某些酶相结合的DNA序列的存在。这些特异的酶能催化DNA链的断裂和重新连接，它们能发动位点特异性重组作用.而在同源重组中，DNA链的切断完全是随机的，结果暴露出一些能与RecA这样的蛋白质相结合的顺序，从而发动交叉重组。λ噬菌体DNA能通过重组作用整合进E.coli染色体的特异位点，成为前病毒（provirus，或称前噬菌体，prophage）。λ的整合作用有两个特点：①这种交换是可逆的，原先存在的DNA顺序全部被保存下来，并无丢失；②噬菌体和细菌的DNA之间有一段很短的同源序列，重组交换必须通过其中的一个特定的核苷酸。这两个特点也就是位点特异性重组的共同特点。一、λ噬菌体的整合（integration）　　λ噬菌体编码λ整合酶（integrase）。这个酶能指导噬菌体DNA插入E.coli染色体中。这种插入作用是通过两个DNA分子的特异位点进行重组，将两个环状DNA分子变成一个大环。在噬菌体感染的早期即有大量整合酶产生，故几乎所有被感染的细胞都发生整合作用。这种作用可用体外模型来进行实验。用四种成份混合起来组成反应系统：纯的整合酶；来自E.coli的一种辅助蛋白，称为整合作用宿主因子（IHF，integration host factor）；镁离子；和含有噬菌体和细菌DNA发生重组交叉的特异位点（称为attP和attB，att源自attachment）的DNA片段。对于这个DNA片段，一个简单的制备方法就是人工构建含attP和attB两者质粒。当整合反应发生时，即在attP和attB处发生交叉重组，产生两个较小的环状DNA。整合反应由整合酶催化，其步骤是彼此偶联的：四条链同时被切断、交叉和重新连接起来，其间没有发现任何稳定的中间产物。这种前文提到的拓扑异构酶Ⅱ的反应很相似，即DNA双链同时被切断，然后磷酸二酯键又重新连接起来，并不需要ATP供应能量。故整合酶实际上能起拓扑异构酶的作用，可使带有att位点（或类似序列）的超螺旋松弛。并且和拓扑异构酶一样，整合酶也产生交错的断裂（staggeredcut）:有七个核苷酸的单键尾端，形成所谓粘性末端。　　整合酶和IHF在att上都有特定的结合位点，体外实验也证明这两种蛋白质结合在attDNA的特定位点上。每一次重组过程需要20－40个整合酶分子及约70个IHF分子。故可能这两种蛋白质不仅是作为酶（发挥催化作用），而且在每次重组中都要形成某种复合物结构。通过缺失实验，证明attP至少要约250bp长，太短将使其功能丧失，而attB则较短，包括核心（core）在内约23bp长即有功能。长250bp的整个attP可绕在整合酶分子的周围，类似核小体的结构，其中含有约8个整合酶的单体，每个的分子量约为40000。attB和attP中有相同的15bp的核心序列。整合酶与两个核心都相结合。如果两个核心中有一个的顺序有所改变，则重组的效率将大为降低。但是如果两个核心序列发生了相同的改变，则顺序交换仍能进行。可见整合酶不但要求特异的序列，而且要求两个核心序列有同源性。　　然而，如果λ前病毒受到诱导（induction），则整合作用将被逆转。此过程称为切出（excision）。切出后，细菌和噬菌体DNA恢复至原来完整状态。前病毒受到诱导时即产生又一种蛋白质，称为切出酶（excisionase）。切出酶和整合酶一起催化前病毒DNA两端的杂种att位点之间的重组。这时，整合酶和切出酶一同紧密结合在细菌前病毒杂种att位点上，显然这样就能促使反应向反方向进行。　　λ噬菌体的整合和切出过程。attB由称为BOB’的序列组成，而attP由POP'组成。O是核心序列，是attB和attP所共同的。而其两侧的序列是B，B’和P，P’，被称为臂。噬菌体DNA是环状的，重组时被整合入细菌染色体中，成为线性序列。前病毒的两侧是两个新的杂种att位点，左侧称为attL，由BOP’组成，而右侧为attR，由POB’组成。可见，整合和切出并不涉及相同的一对序列：整合需要识别attP和attB，而切出要求识别attL和attR。因此，重组位点的识别就决定了位点专一性重组的方向──整合或切出。虽然位点专一重组是可逆的，但反应的方向取决于不同环境条件，这对决定噬菌体的生命力周期是非常性重要的。整合的。整合酶和IHF对整合和切出都是是必需的，而切出酶在控制反应方向上起重要作用──它对切出是必须的，但能抑制整合。在切除的环化过程中如果发生错误，前噬菌体可能失去某些基因而代之以其相邻的细菌基因。因为整合位点处于细菌染色体的gal和bio基因之间，切除过程中噬菌体DNA偶而会带走gal基因，生成λgal（或称λdb）。λgal或λbio转导（感染）新的宿主时常常把gal或bio基因带到新的宿主中去，所以把λgal或λbio这些带有某些宿主基因的噬菌体称为转导噬菌体（transducing phage）。二、基因的表达的调控　　如果一个DNA分子上两个特异位点之间发生重组，其后果有两种可能性：两个位点之间的节段或被丢失，或被颠倒。有些生物能够利用这种重组倒置来控制基因的表达。因为DNA的一正一倒两种排列法可以相应地表达两种不同的蛋白质，细胞就可根据需要作出选择。奇怪的是，利用这种机制所调节的蛋白质往往都位于生物的体表。例如噬菌体Mu的尾蛋白即由其可倒置的DNA节段gin所控制。最著名的例子是沙门氏菌（如鼠伤寒沙门氏菌，Salmonellatyphimurium）的鞭毛抗原。而锥虫（trypanosomes）的表面抗原更是千变万化，用以逃脱宿主免疫系统的攻击，这也是通过一系列DNA重排达到的，其复杂程度有点类似于抗体基因的结构。沙门氏菌的位相是由于它的两种鞭毛蛋白质H1和H2的交迭表达。在某一时期，菌体表达其中的一种，但从不两种均表达。H2基因的启动子位于此基因近旁的一个970bp长的DNA节段（称为hin基因）上，在启动子两端各有一个14bp的反向重复序列（IRL和IRR）。当两个反向位点之间进行重组交叉时，位点之间的节段将被颠倒。　　这两个14bp的反向重复即可用作为核心序列进行位点特异性重组。当此970bp节段朝向某一方向时，启动子即在H2基因的旁边，故H2基因即被转录。同时，邻近一编码阻抑蛋白的基因亦被转录，产生的阻抑蛋白可抑制远方H1基因的表达。因而结果是H2表达而H1不表达。相反，如此970bp节段朝向另一方向，H2基因即不被表达，因为没有了启动子。但同时H1的阻抑蛋白也不再表达，故H1遂得以表达。这个hin基因编码的蛋白质称为Hin酶，此酶就是用以催化倒置（位点特异性重组）的。有人认为，当细胞的生长受到阻碍时，Hin酶的表达就会增高，以便更换一种新的表面抗原。　　噬菌体Mu中的类似系统位于其基因组的右端。这个可倒置的G节段长约3kb，在不同的MuDNA中有不同的方向。当噬菌体生长在E.coliK12中的，感染是溶菌体的。此时G节段的方向称为G（+）。在节段前方的gin基因对G节段的反向反应是必须的。在噬菌体P1中也有一个类似的cin基因，对其C节段的反向反应是必须的。G节段中的基因编码噬菌体吸附在菌细胞表面上所必须的蛋白质。而G节段的方面控制着这些基因的表达。其结果是G（+）和G（-）噬菌体对不同株E.coli有不同的特异性。在G（+）方向，基因S和U表达，其产物使噬菌体可吸附在E.coliK12上，但不能吸附在E.coliC上，反之，在G（-）方向，基因S’和U’表达，噬菌体可吸附在E.coliC上，而不能吸附在E.coliK12上。各蛋白质的分子量为：S56000，U21000，S’48000，和U’26000。一个特殊的发现是它们的综合长度（S＋U或S’＋U’）所需的编码序列大约要4kb长，要比G节段长得多。　　这两套基因编码在DNA的两条互补链上，而它们的共同启动子则位于则位于反向区的左侧。后者长度过短的解释是S和S’蛋白有一个共同的N端序列（Sc），Sc序列不由反向区编码。而两者不同的C端序列Sv和S'v的表达则决定于反向区的方向。U和U’基因则是独立编码的。　　Mu噬菌体的gin和沙门氏菌的hin的功能相似，它们在体外实验中甚至可互相替代。在E.coli中也有一类基因，称为pin。它能促使其邻接的约7800bp长的DNA节段倒置。在这个可倒置节段的两端有29bp长的反向重复。现在尚不了解这个反应有何功能。　　在体外亦可进行Gin或Hin介导的倒置反应，但还额外需要：①一个宿主编码的末知蛋白质和②底物DNA必须具有超螺旋。另外，底物DNA上除重组位点外还要一段约60bp的DNA序列，这个序列可位于底物分子上任何部位（除了十分靠近重组位点外）。此序列位置的任意性似乎与转录作用中的增强子类似，故有人称之谓重组增强子。