刘芝华 中国医学科学院肿瘤研究所 分子肿瘤学国家重点实验室
概念：
基因组文库是含有某种生物体全部基因的随机片段的重组DNA克隆群体；cDNA文库是指含有所有重组cDNA的克隆群体。
基因组文库：来源于基因组DNA，反映基因组的全部信息，用于基因组物理图谱的构建，基因组序列分析，基因在染色体上的定位，基因组中基因的结构和组织形式等。
cDNA文库：来源于细胞表达出的RNA，反映基因组表达的基因序列信息，用于研究特定细胞中基因的表达状态和表达基因的功能等。
基因文库＝基因组文库＋cDNA文库
载体的种类和特征：
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受体细胞 |
结构 |
插入片段 |
举例 |
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质粒 |
E.coli |
环状 |
很小，<8kb |
pUC18/19 ,T-载体,
pGEM3z |
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λ噬菌体 |
E.coli |
线状 |
9-24kb |
EMBL，λgt系列 |
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丝状噬菌体及噬菌粒 |
E.coli |
环状 |
<10kb |
M13系列 |
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粘粒载体 |
E.coli |
环状 |
35-45kb |
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BAC |
E.coli |
环状 |
约300kb |
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PAC |
E.coli |
环状 |
100-800kb |
PCYPAC |
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YAC |
酵母细胞 |
线性染色体 |
100-2000kb |
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MAC |
哺乳动物细胞 |
环状 |
>1000kb |
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病毒载体 |
动物细胞 |
环状 |
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SV40 载体，昆虫杆状病毒载体 |
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穿梭载体 |
动物细胞和细菌 |
环状 |
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pSVK3质粒，PBV,Ti质粒， |
基因组文库构建步骤：
· DNA的制备：高分子量的外源DNA 100-150kb
· 剪切：随机切割
· 载体：
l噬菌体：48.5kb,插入型(最多可容纳9kb)、取代型(可容纳 38-51kb，最适19-20kb)， EMBL, Charon 粘性质粒(Cosmid)：4-6kb, 质粒 噬菌体的性质，可容纳大片段的外源基因，最多可容纳46kb。
酵母人工染色体克隆体系（YAC，Yeast Artificial Chromosome Cloning System）
插入大小200—1000kb
· 载体DNA的制备：
载体DNA酶切反应-----载体臂的纯化-----载体脱磷处理 （常用BamHI） （蔗糖密度梯度离心） （碱性磷酸酶）
· 连接和包装：外源片段与两臂之间的比例，包装蛋白
· 感染宿主菌：选择合适的宿主菌，LE392, NM538, NM539, KW251等
· 基因组文库的保存和扩增：完整性和代表性
测滴度，要在106fu以上; 保存，氯仿4℃，7% DMSO -70℃
人类染色体3X109，平均插入片段大小17 kb
cDNA文库的构建
· 分类： 按表达类型分：表达型、非表达型
按载体类型分：质粒cDNA文库、噬菌体cDNA文库
· cDNA文库的构建步骤：
· 关键：mRNA的获得。完整、种类多、不能降解。电泳应在0.5-8kb之间。已知探针做Northern或PCR。
· 反转录：AMV鸟成髓细胞性白血病病毒
M-MLV 鼠白血病病毒
引物：oligo dT, Random primer
掺入同位素检测
· cDNA第二链的合成
· 载体： lgt10, lgt11, lZAP等。
克隆入l噬菌体的效率是克隆入质粒中的30倍。
l ZAP II：(i) l噬菌体高效；(ii) 质粒易操作；(iii) 蓝白斑；(iv) 插入大小10kb；(v) 可表达融合蛋白，可用DNA探针或抗体来筛选；(vi) 体内自我剪切
· 从少量RNA中建cDNA文库：
一般情况下，只有10%的mRNA可变成可克隆的双链cDNA，而且体外包装和细菌转化都会再次降低效率，很多人结合PCR，但有非特异性。
---结合Solid-phase RNA Capture System, 可用5ng mRNA，这时oligo dT结合在一个磁珠上，做第二链的模板；
---用Universal Buffer，从cDNA第一、第二链的合成，到连Linker等全在一个系统内进行。
· cDNA文库的标准化：使高丰度的信息相对减少、低丰度的信息相对增多的过程。
减少反复重复，但也会丢失一些信息。
----与基因组DNA杂交；---应用二级动力学原理在溶液中使双链DNA再退火。
理论上，在单细胞中，去除高丰度者可使低丰度者聚集3倍或更少。因为细胞中1/3mRNA在细胞中有1-10拷贝。
· 定向克隆的cDNA文库：大量EST测序时会用到。
· 好的cDNA文库的标准：
---具有代表性，含所有带PolyA尾的RNA群体且各类型出现频率也与之一致；
---大部分含有较长或全长的cDNA插入序列；
---少有基因组、线粒体DNA、核糖体RNA的污染。
· cDNA文库的筛选：
DNA探针，抗体，标记蛋白
文库的扩增：
噬菌体文库加SM，粘粒和质粒文库LB。
文库的保存：
噬菌体文库：4℃（加氯仿）可保存几年，-70℃（7% DMSO）
长期保存；粘粒和质粒文库：15%甘油，-70℃冻存。
文库的筛选：
·选择文库
·所要筛选的克隆数：
--对基因组文库取决于克隆片段的大小和基因组的大小
N=Ln(1-P)/Ln[1-(I/G)]
其中I：克隆片段的随机大小，G：靶基因组的大小，P：分离到基因的概率。
--对cDNA文库取决于所要片段的表达丰度和基因组的大小
用核酸做探针还是用抗体做探针
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