生物实验技术
目 录
第一章 基因克隆
1.操作流程---------------------------------------------------- 1
2.方法-------------------------------------------------------- 1
2.1 设计引物 ------------------------------------------- 1
2.2 PCR------------------------------------------------- 1
2.3 割胶回收目的片段------------------------------------ 2
2.4 连接------------------------------------------------ 3
2.5 感受态细胞制备及转化-------------------------------- 3
2.6 接菌------------------------------------------------ 4
2.7 阳性克隆鉴定---------------------------------------- 5
2.8 质粒抽提-------------------------------------------- 5
2.9 测序------------------------------------------------ 6
3.基因克隆的编码---------------------------------------------- 6
第二章 酵母双杂交筛选
1.操作流程---------------------------------------------------- 7
2.方法-------------------------------------------------------- 7
2.1 诱饵基因转化筛库宿主菌 Y190------------------------- 7
2.2 含Bait基因质粒的Y190保种 ------------------------- 8
2.3 Bait 基因的自激活检测 ------------------------------ 9
2.4 诱饵基因筛库--------------------------------------- 10
2.5 抽提酵母质粒--------------------------------------- 13
2.6 酵母质粒的扩增------------------------------------- 14
2.7 Prey质粒与Bait质粒共转Y190----------------------- 16
第三章 细胞培养和转染
1.细胞培养--------------------------------------------------- 17
2.细胞转染--------------------------------------------------- 17
2.1 脂质体介导的贴壁细胞转染法------------------------- 17
2.2 磷酸钙介导的贴壁细胞转染法------------------------- 18
3.相关试剂--------------------------------------------------- 19
第四章 免疫共沉淀
1.操作流程--------------------------------------------------- 20
2.方法------------------------------------------------------- 20
2.1 收获细胞------------------------------------------- 20
2.2 Protein G beads 悬液的制备------------------------- 20
2.3 Preclear ------------------------------------------ 21
2.4 免疫共沉淀----------------------------------------- 21
3.试剂------------------------------------------------------- 22
第五章 Western Blot
1.操作流程--------------------------------------------------- 23
2.方法------------------------------------------------------- 23
2.1 电泳----------------------------------------------- 23
2.2 转膜----------------------------------------------- 23
2.3 杂交----------------------------------------------- 24
2.4 显色----------------------------------------------- 24
2.5 膜的 strip----------------------------------------- 24
3.试剂------------------------------------------------------- 25
第六章 报告基因检测系统
1.NF-kB 报告基因检测系统------------------------------------- 26
1.1 细胞培养------------------------------------------- 26
1.2 转染----------------------------------------------- 27
1.3 细胞收获及处理------------------------------------- 28
1.4 luciferase 分析------------------------------------ 28
1.5 Western-blot检测待检基因的表达情况----------------- 28
2.p53报告基因检测系统---------------------------------------- 29
2.1 细胞培养及铺板------------------------------------- 29
2.2 转染----------------------------------------------- 29
2.3 细胞收获及处理------------------------------------- 30
2.4 luciferase 分析------------------------------------ 30
2.5 Western-blot检测待检基因的表达情况----------------- 31
3.NFAT报告基因检测系统--------------------------------------- 31
3.1 细胞培养------------------------------------------- 31
3.2 电击转化------------------------------------------- 31
3.3 铺板加药------------------------------------------- 32
3.4 细胞收获及处理------------------------------------- 33
3.5 Luciferase 检测------------------------------------ 33
3.6 Western-blot检测待检基因的表达情况----------------- 33
4.Western-blot----------------------------------------------- 33
5.注释------------------------------------------------------- 35
5.1 几种药物的储存浓度和应用浓度----------------------- 35
5.2 各系统的control------------------------------------ 36
5.3 Lumat LB P507仪器操作步骤-------------------------- 36
第七章 流式细胞分析分选术
1.96孔板样本处理--------------------------------------------- 41
1.1 操作流程------------------------------------------- 41
1.2 方法----------------------------------------------- 41
1.3 注释----------------------------------------------- 28
2.Cell Cycle Assay------------------------------------------- 42
2.1 细胞培养及铺板------------------------------------- 42
2.2 转染----------------------------------------------- 43
2.3 细胞分板------------------------------------------- 43
2.4 加药刺激------------------------------------------- 43
2.5 细胞收获及处理------------------------------------- 44
2.6 上机样本制备--------------------------------------- 44
2.7 上机----------------------------------------------- 44
2.8 相关试剂的配制------------------------------------- 44
3. ACS analysis on Apoptosis -------------------------------- 45
3.1 细胞培养及铺板------------------------------------- 45
3.2 转染----------------------------------------------- 46
3.3 细胞收获------------------------------------------- 47
3.4 上机样本制备--------------------------------------- 47
3.5 上机----------------------------------------------- 47
4.CD69检测-------------------------------------------------- 48
4.1 细胞培养------------------------------------------- 48
4.2 电击转化------------------------------------------- 48
4.3 铺板加药------------------------------------------- 49
4.4 细胞收获及处理------------------------------------- 49
4.5 样本制备------------------------------------------- 50
4.6 上机----------------------------------------------- 51
4.7 几种药物的储存浓度和应用浓度----------------------- 51
5.细胞分选--------------------------------------------------- 52
5.1 分选细胞样本处理----------------------------------- 52
5.2 分选细胞的上机操作程序----------------------------- 53
5.3 相关试剂的配制------------------------------------- 53
第八章 siRNA技术
1.方法------------------------------------------------------- 54
2.注释------------------------------------------------------- 54
2.1 不同培养体积贴壁细胞用 RNAfect 转染时的初始条件---- 55
2.2 在24孔平板中优化RNAfect转染效果的方法------------ 55
2.3 在24孔平板中优化 RNAfect转染效果的方法------------ 55
第九章 杆状病毒表达系统
1.操作流程--------------------------------------------------- 56
2.方法------------------------------------------------------- 56
2.1 共转染--------------------------------------------- 56
2.2 病毒扩增------------------------------------------- 57
2.3 滴度与plaque纯化---------------------------------- 58
2.4 小规模表达带有 His标签的目的基因------------------ 59
3.昆虫细胞Sf9的培养条件------------------------------------- 59
3.1 培养基--------------------------------------------- 59
3.2 培养方式------------------------------------------- 60
2.3 细胞的冻存和解冻----------------------------------- 60
2.4 无血清适应----------------------------------------- 61
第十章 蛋白的表达和纯化
1.基因表达载体构建------------------------------------------- 62
1.1 操作流程------------------------------------------- 62
1.2 方法----------------------------------------------- 62
2.蛋白纯化--------------------------------------------------- 64
2.1 重组蛋白的提取------------------------------------- 64
2.2 金属鳌合层析(IMAC)--------------------------------- 65
2.3 谷胱苷肽配体亲合层析(GAF)-------------------------- 66
2.4 离子交换层析(IEC)---------------------------------- 66
2.5 凝胶过滤(GF)--------------------------------------- 67
3.蛋白浓度测定----------------------------------------------- 68
第十一章 RNA技术
1.组织Total RNA提取------------------------------------------69
1.1 组织取材和保存------------------------------------- 69
1.2 组织的破碎和匀浆----------------------------------- 69
1.3 总RNA的抽提--------------------------------------- 70
2.荧光定量PCR (Q-PCR)---------------------------------------- 71
2.1 Q－PCR反应体系------------------------------------- 71
2.2 Q－PCR反应程序------------------------------------- 71
第十二章 抗体的制备和纯化
1.多克隆抗体的制备------------------------------------------- 72
2.单克隆抗体的制备------------------------------------------- 72
2.1 免疫物------------------------------------------- 72
2.2 细胞融合------------------------------------------- 73
2.3 细胞筛选------------------------------------------- 74
2.4 细胞克隆------------------------------------------- 75
2.5 细胞扩增------------------------------------------- 75
2.6 细胞冻存------------------------------------------- 75
2.7 腹水制备------------------------------------------- 76
2.8 腹水的纯化----------------------------------------- 76
2.9 杂交瘤鉴定----------------------------------------- 76
3.Peptide-KLH的偶联及-SH偶联率测定方法---------------------- 76
3.1 Peptide-KLH偶联------------------------------------ 76
3.2 -SH偶联率测定------------------------------------- 77
3.3 Cys标准曲线制作----------------------------------- 77
3.4 -SH偶联率换算公式--------------------------------- 78
3.5 透析及分装保存-------------------------------------- 78
第十三章 病理实验基本技术
1.基本技术--------------------------------------------------- 79
2.常规制片--------------------------------------------------- 79
2.1 操作流程------------------------------------------- 79
2.2 方 法---------------------------------------------- 79
3.免疫组织化学----------------------------------------------- 81
4.免疫细胞化学----------------------------------------------- 82
5.组织微阵列------------------------------------------------- 82
6.常规溶液配制----------------------------------------------- 82
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