| 微生物学分子生物学技术 | | 点击： 作者：51protocol收集 来源： 时间： 2007-06-02 本站论坛 |
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微生物学分子生物学技术
一、质粒DNA提取及琼脂糖凝胶电泳
（一）碱变性法提取质粒DNA
质粒(Plasmid) 是细菌染色体外能自身独立复制的双股环状DNA。带有遗传信息，可赋予细菌某些新的表型。将质粒指纹图谱分析方法、质粒DNA探针技术及检测质粒的PCR技术用于临床感染性疾病的诊断和流行病学调查已成为现实。质粒作为载体在基因工程中起着重要的作用。
分离和纯化质粒DNA的方法很多,但这些方法基本包括三个步骤：即细菌的培养和质粒DNA的扩增，细菌菌体的裂解; 质粒DNA的提取与纯化。
本实验学习用碱变性方法提取质粒DNA。
【原理】
细菌培养物加入SDS和NaOH 碱性溶液处理后，菌体裂解，可使细菌的质粒DNA、染色体DNA和RNA一起从细胞内释放出来，经琼脂糖凝胶电泳，因各种核酸分子的迁移率不同将上述核酸分成不同的带。用溴化乙锭（EB）染色后，在紫外线灯下可看到各种核酸带发出的荧光。根据荧光的位置，可区分不同的核酸带。
【材料】
1．菌株 E.coli JM109（pUC19），E.coli RRI（pBR322）
2．试剂 溶液Ⅰ( 50 mM葡萄糖, 25 mM Tris.Hcl PH 8.0, 10 mM EDTA)
溶液 II ( 0.2 N NaOH，1%SDS) 用前新配制
溶液III ( 5 mM KAc溶液PH4.8)
TE缓冲液 (10mMTris.Hcl ,1mMEDTA PH8.0)
LB液体培养基( 胰蛋白胨 10g,，酵母粉5g, Nacl 10g. 加蒸馏水溶解，用NaOH调PH 至7.5，加水至1000 ml,15磅高压灭菌15分钟)。
【方法】
1．接种细菌于5ml LB液体培养基中，370C培养过夜。
2．3000 rpm/min,离心15min，弃上清。加入100ul 溶液1悬起细菌沉淀。
3．加入200ul前新配制的溶液II ，颠倒EP管5次混合均匀，置冰浴2min。
4．加入150ul溶液III温和地混匀，12000 rpm/min,离心5min。
5．吸取上清清亮裂解液放入另一新EP 管中，加等体积酚-氯仿-异戊醇抽提2次，12000 rpm/min,离心2min。（若不做酶切，此步可省略）吸取上清放入另一新EP 管中，加入二倍体积的冷乙醇，12000 rpm/min,离心10min。
6．弃乙醇，干燥后用30ul TE缓冲液洗下核酸，待电泳检测。
（二）琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳技术（Agarose gel electroghoresis）是分离、鉴定和提纯DNA片断的有效方法。凝胶分辨率决定于使用材料的浓度，并由此决定凝胶的孔径。琼脂糖凝胶可分辩0.1~6.0kb的双链DNA片段。琼脂糖凝胶电泳是一个电场作用。它首先利用琼脂糖的分子筛效应，此外，在弱碱性条件下，DNA分子带负电荷，从负极向正极移动。根据DNA分子大小、结构及所带电荷的不同，它们以不同的速率通过介质运动而相互分离。借助溴化乙锭（EB）能与双链DNA结合的作用，利用EB染色，并通过紫外线激发即可观察被分离DNA片段的位置。
【材料】
1．琼脂糖、10×TAE电泳缓冲液（40m MTris ,20 mM NaAc,1mM EDTA PH8.0）
2．载体缓冲液（0.25%溴酚蓝，30%甘油）、溴化乙锭水溶液（10mg/ml ）
3．凝胶槽、电泳仪
【方法】
1．取琼脂糖0.9g，加入100ml 1x TAE电泳缓冲液于250ml烧瓶中，1000C加热溶解。
2．平衡凝胶槽，放好两侧挡板，调节好梳子与底板的距离（一般高出底板0.5~1mm）。
3．铺板：在溶解好的凝胶中加入终浓度为0.5ug/ml 的溴化乙锭水溶液，轻轻混匀，待冷至500C左右倒入凝胶槽，胶厚一般为5~8mm。
4．待胶彻底凝固后，去掉两侧挡板，将凝胶放入盛有电泳液的槽中（加样孔朝向负极端，DNA由负极向正极移动），使液面高出凝胶2~3mm，小心拔出梳子。
5．DNA 样品与载体缓冲液5：1混合并加入凹孔中（样品不可溢出）。
6．打开电源，调节所需电压，电压与凝胶的长度有关，一般使用电压不超过5v/cm。
7．据指示染料移动的位置，确定电泳是否终止（溴酚蓝的涌动距离在5s RNA和0.3 kb DNA 带之间）。
8．电泳完毕关闭电源。将凝胶放紫外灯下观察并拍照。
二、 DNA的限制性核酸内切酶酶切实验和连接实验
（一）酶切实验
本实验学习用限制性核酸内切酶（Restriction endonuclease）EcoRI 切割λDNA及质粒pBR322DNA，琼脂糖凝胶电泳后观察酶切结果。
【原理】
λDNA 是大肠杆菌的一种温和噬菌体DNA，双股线状，分子大小为48.5 kb。 EcoRI酶可识别DNA中 G↓AATTC核苷酸序列，并在箭头处将其切开。λDNA含有5个EcoRI酶识别位点，可将λDNA切成6个大小不同的片断。pBR322 DNA为人工构建的质粒DNA, 分子大小为4.3 kb，含有1个EcoR I酶切点，切割后由环状DNA变为线形DNA。
【材料】
1．λDNA(0.1ug/ul)，pBR322 DNA（0.25 ug/ul）
2．限制性内切酶EcoRI
3．EcoRI 酶切缓冲液（Buffer solution 10×）
4．去离子水
5．电泳及染色用材料
【方法】
1．取洁净EP管2只，按表10－1加入各成分。
2．混匀，放370C水浴1-2h。65℃水浴10min，再放4℃冰箱8min终止反应。部分酶切DNA片段用于DNA连接实验，另一部分放4℃冰箱，待琼脂糖凝胶电泳检测。
（二）DNA连接实验
T4 DNA 连接酶是一单链多肽，分子量为68,000道尔顿，它能催化双链DNA上相邻的3ˊ羟基和5ˊ磷酸末断形成磷酸二脂键。λDNA用EcoRI酶切割后形成的6个片断均具有粘性末端（Cohesive ends），在T4 DNA 连接酶作用下，可连接成原来的线状DNA
【材料】
1．λDNAEcoRI酶切片段
2．T4 DNA连接酶
3．T4 DNA连接酶缓冲液（10×）
4．去离子水
【方法】
1．取洁净EP管1只，分别加入：
①去离子水 7ul,
②T4 DNA连接酶缓冲液（10×） 2 ul，
③λDNA酶切片段（已65℃10分钟灭活）10ul
④T4 DNA连接酶1ul
2．混匀后，放13℃水浴过夜，待电泳检测。
三、耐药质粒 DNA转化实验
本实验学习将质粒DNA分子转入大肠杆菌的方法及如何筛选带有质粒DNA的细胞克隆，即转化子。
【原理】
受体菌Ecoli RRI 在低温条件下经Ca 处理，可改变细胞膜的通透性，利于受体菌对DNA的摄取，这种经Ca 处理的细菌称感受态菌。pBR322 质粒带有氨基苄青霉素（Ap）和四环素（Tc）基因，如将pBR322质粒转入到对上述抗生素敏感的Ecoli RRI菌体内，则可使该细菌获得Apr和Tcr，表现出对Ap和Tc的抗药性。
（一）感受态菌的制备
【材料】
1．菌株 E.coli RRI
2．LB 液体培养基
3．75mM Cacl2
4．其它：灭菌小试管、刻度吸管、微量加样器、离心机
【方法】
1．将细菌接种于5ml LB液体培养基中，37℃振荡培养16~20h。
2．取新鲜菌液，按1/100的接种量接种于LB培养基中，37℃振荡培养2~3h。
3．取1.5ml菌液，4℃ 3000rpm/min,离心5min，弃上清。
4．菌体沉淀加入750μl预冷的（4℃）75mmol/L CaCL2 溶液，轻轻吹打菌悬液，放冰浴30min。
5．4℃3000rpm/min,离心5min，弃上清。
6．菌体沉淀加入200微升预冷的75mmol/LCaCL2溶液，冰浴4min以上。4℃保存备用。
（二）质粒转化
【材料】
1．pBR322 质粒DNA,
2．感受态菌75mmol CaCl2
3．LB肉汤培养基，无药LB琼脂平板，氨苄青霉素琼脂平板（50ug/ml）
4．其它：灭菌小试管，L形玻璃棒
【方法】
1. 取2个洁净，灭菌的EP管，按表10－2加入各成分：
2. 上述2个试管充分混均匀后，置冰浴30min。
3. 42℃2min或37℃5min，立即置冰浴2min。
4. 加入1ml LB肉汤培养基，37℃静止培养1h。
（三）转化子筛选：
1．取实验组培养菌液涂布在氨苄青霉素琼脂平板（50ug/ml）上，对照组菌液分别涂布在无药LB琼脂平板和氨苄青霉素琼脂平板上，每块板涂0.1ml，用灭菌L形玻璃棒涂匀。将涂好的平板置370C培养过夜，观察转化结果。
2．E.coli 受体菌不含有质粒DNA，也不含Apr和Tcr 。在含Ap和Tc的培养基中不能生长,若实验组在含Ap和Tc的平板上出现菌落，可初步确定受体菌获得了耐药性质粒，然后再通过提取质粒DNA进一步鉴定转化子。
四、 PCR方法检测病原微生物
多聚酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)是一种模拟天然DNA复制过程，在体外扩增特异性DNA（或RNA）片段的新技术。本实验是将待检双链DNA经94℃高温变性成单链作模板，然后加入一对人工合成的寡核苷酸引物，引物分别与待扩增DNA片段的两端互补，经55℃低温退火，引物与模板互补结合。在72℃条件下，结合于模板上的引物在DNA聚合酶的催化下，利用反应体系中的4种dNTP为原料，按碱基互补配对的方式延伸合成两条新的DNA链。经过20-30个周期后，特异的目的DNA可扩增百万倍以上。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后即可观察到特异的扩增条带。
PCR方法操作简便，灵敏度高，可检测出少至0.1pg的目的DNA。目前已广泛应用于多种病原微生物及寄生虫的检测。
【材料】
1．无菌双蒸水、石蜡油、溴化乙锭
2．10×PCR反应缓冲液
3．25mmol dNTP混合液
4．引物1，引物2各50pmol／u1
5．模板DNA
6．5U／ul Taq DNA聚合酶
【仪器】
1．PCR扩增仪
2．电泳仪
3．紫外线分析仪
【方法】
1．在0.5m1EP管中，加入以下成分：
10×PCR反应缓冲液 5u1
引物1 2ul
引物1 2ul
模板DNA 10u1
dNTP混合液 4ul
Taq DNA聚合酶 1ul
无菌双蒸水 加至 50ul
混匀, 加50 ul石蜡油，防止样品水分蒸发。
2．将反应管置于PCR仪中，94℃变性4min。然后按94℃变性30s→55℃退火30s→72℃延伸1min，循环35次后，72℃延伸10 min。
3．反应完成后，取l0ul PCR扩增液，加至2％琼脂糖凝胶中进行电泳，电压100V，电泳30~60min后，置紫外线分析仪下观查扩增结果。
五、核酸杂交法检测病原微生物
核酸杂交技术是根据两条互补的核苷酸单链可以杂交结合成双链的原理所建立，用一段已知序列的放射性或非放射性标记的核苷酸单链做探针，与待检标本中的DNA杂交来探查待检标本中有无与之相互补的核酸。该方法特异性高，但敏感性低于PCR方法。
本实验学习用非放射性标记物-地高辛(DIG)标记DNA片段作探针，用斑点杂交法检测病原微生物DNA的方法。
【原理】
用地高辛（DIG）类固醇半抗原标记特异DNA片段做探针，与待检标本中DNA杂交，然后加入碱性磷酸酶标记的抗－DIG抗体（抗DIG-AP），再加入碱性磷酸酶的作用底物（NBT/BCIP），若待检标本中有与探针同源的DNA序列，则探针与其杂交并与抗DIG-AP结合，碱性磷酸酶催化底物呈色，则在杂交膜上出现兰色斑点或条带。该探针可用于斑点杂交，菌落原位杂交及Southern blot杂交。
（一）DIG-DNA探针的制备（随机引物法标记）
【材料】
1．待标记DNA (0.5~3ug)
2．六核苷酸混合物 ( hexanucleotide mix)
3．dNTP标记混合物，Klenow enzyme
4．其它试剂4M LiCl，无水乙醇，TE溶液（10mMTris-HCl，lmM EDTA PH8.0）；0.2M EDTA pH8.0
【方法】
1．取待标记DNA(0.5~3ug)，加无菌去离子水至终体积15ul，于沸水浴变性10分钟后迅速置冰／氯化钠中冷却。
2．在冰／氯化钠上添加：
2ul 六核苷酸混合物( hexanucleotide mix)
2ul dNTP mix
1ul Klenow enzyme
3．混匀并短暂离心，然后于37℃孵育至少60分钟。
4．加入2ul 0.2M EDTA，pH8.0以中止反应。
5．加入2.5ul 4M LiCl及75ul经-20℃预冷的无水乙醇，充分混匀， -70℃放置30分钟或-20℃放置2h。
6．12000rpm/min离心15min，用50ul预冷的70％乙醇洗涤沉淀物。
7．真空短暂干燥，用50ulTE溶液溶解沉淀。
【说明】
DIG标记的DNA片断大小为200~1000bp。每次标准标记反应模板DNA量为0.5~3ug，如标记大量DNA需相应增加反应物和反应体积。若延长37℃孵育时间(到20h)可增加DIG标记产物量。
（二）斑点杂交法
【材料】
1．硝酸纤维素膜，待检标本DNA
2．标准预杂交液（5× SSC；0.1％月桂酸；0.02％SDS；1／10体积的10倍浓缩阻断液(含变性并剪切的鲑精DNA)。
3．洗液1（2×SSC，0.1%SDS）; 洗液2 (0.1×SSC，0.1 %SDS)。
【方法】
1．杂交膜的制备
①将从待检标本提取的核酸（质粒或 染色体DNA）100℃ 10 min 煮沸变性，迅速置冰／氯化钠中冷却。
②膜的处理：用2×SSC ，湿润均匀，37℃烘干后，即可点样
③点样：取变性待检核酸1ul 点在硝酸纤维素膜（0.45um）上，同 时设阳性和阴性对照，室温干燥。
④80℃真空干燥2h，将DNA固定于膜上。
2．预杂交及杂交
①预杂交：将杂交膜放入装有适当体积预热的标准预杂交液的杂交 袋或杂交杯中 ，37℃预杂交 30分钟，轻轻搅拌使膜在该温度下孵育。
②将DIG标记的DNA探针置沸水浴5min后，迅速用冰水冷却以变 性DNA探针。
③将变性的DIG标记DNA探针加入到预热的标准预杂交液(2.5ml／ cm2)中并充分混匀。
④将杂交膜放到含DIG标记探针的杂交液中。轻轻搅拌，在68℃ 孵育至少6h（对于检测微量DNA中的单拷贝基因则需孵育16h）。
⑤杂交后洗涤：用足够量的2×SSC，0.1%SDS室温漂洗2次，每次5min；用0.1×SSC，0.1%SDS 68℃漂洗2次，每次15min，漂洗过程中需不断轻轻搅拌。
（三）免疫学检测
【材料】
1．马来酸缓冲液（0.1M马来酸，0.15M Nacl。pH7.5）
2．洗液（马来酸缓冲液加入0.3％吐温20(v/v)）
3．阻断液（10×浓缩的阻断液经马来酸缓冲液10倍稀释，新鲜配制）
4．检测液（lM Tri s-HCl，0.1MNaCl，50mM Mgcl2，pH9.5（20℃预热）
5．显色基底液（加200ul NBT/BCIP浓缩液到10ml检测液中，新鲜配制）
【方法】
1．将经过杂交和严格清洗后的膜用马来酸缓冲液漂洗1~5min；将膜在l00ul阻断液中孵育30min。
2．用阻断液稀释抗D1G抗体至适宜浓度(1：5000左右)。
3．倾出封闭液，将膜在20ml抗DIG抗体溶液中孵育膜30min；马来酸缓冲液洗膜2次，每次15min，再用2m1检测液平衡膜2~5min。
4．将杂交膜在现配制的显色基底液中孵育，并用塑料袋或盒在暗室中密闭保存（显色过程中不能摇动）。
5．几分钟内可有颜色沉淀形成（16h完成反应，反应过程中可短暂暴露于阳光下以观察反应进展）。
6．当颜色斑点（或条带）达到一定强度后，可用50ml去离子水或TE溶液洗膜5min以中止反应。
7．显色后的滤膜可封存于聚乙烯袋内或拍照片保存。
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