| DNA的限制性核酸内切酶酶切实验和连接实验 | | 点击： 作者：51protocol收集 来源： 时间： 2007-06-02 本站论坛 |
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DNA的限制性核酸内切酶酶切实验和连接实验
（一）酶切实验
本实验学习用限制性核酸内切酶（Restriction endonuclease）EcoRI 切割λDNA及质粒pBR322DNA，琼脂糖凝胶电泳后观察酶切结果。
【原理】
λDNA 是大肠杆菌的一种温和噬菌体DNA，双股线状，分子大小为48.5 kb。 EcoRI酶可识别DNA中 G↓AATTC核苷酸序列，并在箭头处将其切开。λDNA含有5个EcoRI酶识别位点，可将λDNA切成6个大小不同的片断。pBR322 DNA为人工构建的质粒DNA, 分子大小为4.3 kb，含有1个EcoR I酶切点，切割后由环状DNA变为线形DNA。
【材料】
1．λDNA(0.1ug/ul)，pBR322 DNA（0.25 ug/ul）
2．限制性内切酶EcoRI
3．EcoRI 酶切缓冲液（Buffer solution 10×）
4．去离子水
5．电泳及染色用材料
【方法】
1．取洁净EP管2只，按表10－1加入各成分。
2．混匀，放370C水浴1-2h。65℃水浴10min，再放4℃冰箱8min终止反应。部分酶切DNA片段用于DNA连接实验，另一部分放4℃冰箱，待琼脂糖凝胶电泳检测。
（二）DNA连接实验
T4 DNA 连接酶是一单链多肽，分子量为68,000道尔顿，它能催化双链DNA上相邻的3ˊ羟基和5ˊ磷酸末断形成磷酸二脂键。λDNA用EcoRI酶切割后形成的6个片断均具有粘性末端（Cohesive ends），在T4 DNA 连接酶作用下，可连接成原来的线状DNA
【材料】
1．λDNAEcoRI酶切片段
2．T4 DNA连接酶
3．T4 DNA连接酶缓冲液（10×）
4．去离子水
【方法】
1．取洁净EP管1只，分别加入：
①去离子水 7ul,
②T4 DNA连接酶缓冲液（10×） 2 ul，
③λDNA酶切片段（已65℃10分钟灭活）10ul
④T4 DNA连接酶1ul
2．混匀后，放13℃水浴过夜，待电泳检测。
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