酶的提取、分离、纯化及其活力测定
一、实验目的
酶是植物体内具有催化作用的蛋白质，植物体内的生化反应，一般都是在酶的作用下进行的，没有酶的催化反应，植物的生命也就停止了，因此对酶的研究是阐明生命现象本质中十分重要的部分。为要研究酶首先要将酶从组织中提取出来，加以分离、纯化，不同的研究目的对酶制剂的纯度要求也不相同，有些工作只需要粗的酶制剂即可，而有些工作则要求较纯的酶制剂，需根据不同情况区别对待。在酶的提取和纯化过程中，自始至终都需要测定酶的活性，通过酶活性的测定以监测酶的去向。
二、实验原理
（一）酶的提取
1.酶的存在位置？
存在于动植物以及微生物的细胞的各个部位。
2.如何将酶从细胞中分离？
从高等植物中提取酶常遇到一些实际问题，首先是细胞中含有许多种酶，每种酶的浓度又很低，只占细胞总蛋白质中的极小部分（叶中的双磷酸核酮糖羧化酶除外），而许多植物组织中蛋白质的含量又很低。此外，各种酶的存在状态不同，有在细胞外的外酶，在细胞内的内酶，内酶中又有与细胞器一定结构相结合的结合酶，也有的存在于细胞质中，提取时都应区别对待，作不同处理。如果酶仅存在于细胞质中，只要将细胞破碎，酶就会转移到提取液中；但如果是与细胞器（如细胞壁、细胞核、线粒体、原生质膜、微粒体等）紧密结合的酶，这时如仅仅破碎细胞还不够，还需要用适当的方法将酶从这些结构上溶解下来。其次，细胞中存在抑制物质，如酚，酸，离子等，它们通常在液泡中，当细胞破碎时，这些物质象蛋白质一样从细胞中释放出来，进入提取液中，特别是酚类物质，具有游离的酚羟基，能与蛋白质肽键的氧原子形成强的氢键，不能为一般的实验方法，如透析和凝胶过滤所解离。酚易氧化产生醌，醌为一种强氧化剂，会使蛋白质的功能团发生氧化或发生聚合，使蛋白质上的反应基团，如—SH，—NH2，通过1，4—加成反应而发生不可逆的聚合作用，使酶失活，也使植物组织和提取液产生棕色，以致影响酶活性的测定。因此如果没有特殊需要，一般常选用植物的非绿色部分或者黄化的幼苗，在这些组织中一般酚类化合物含量较低。在提取过程中为了尽量减少酚类的影响，一般提取液常选用高pH值的缓冲溶液，因为在高pH值时，酚类大部游离而不与蛋白质形成强的氢键，但高pH值促进酚类氧化，同时降低酚类吸附剂（如PVP）的有效性，通常采用pH6.7梍7.2。已经知道PVP能与游离酚羟基形成强的氢键复合物，是酚类化合物的有效结合剂。在提取线粒体时加入可溶性PVP，提取可溶性酶时加入不溶性交联PVP（Polyvinyl polypyrrolidone，简称PVPP，或Polyclar AT），能有效地降低提取液中酚的含量。PVPP含有微量金属元素及PVP单体，可加10% HCl煮沸10分钟，用NaOH中和，再用水洗几次，直至中性，纯化后的PVPP不必干燥就可直接应用。
植物细胞有坚韧的细胞壁，需要强烈的方法去破碎，少量样品可用研钵加石英砂研磨，或用玻璃匀浆器。大量样品则需用电动匀浆器。为减低研磨或匀浆过程中发热，所用器皿和溶液需要预冷，提取液的用量一般为组织的1梍5倍，用量大些有利于提高得率，但工作量大，一般宁可用量小些，将残渣再提取一次。提取匀浆时加入酚类结合剂PVPP，金属螯合剂Na2─EDTA，以及─SH化合物以保护蛋白质，或加入非离子型去垢剂如Triton X─100，以增加蛋白质的可溶度，常用于与膜脂结合的酶。总之，可以通过试验以确定提取蛋白质的最佳条件。
（二）分离和纯化
1.酶的粗提液是否只有酶，有没有其它物质？
上面制备得到的提取液中，除含有所需要的酶外，还含有其他蛋白质，以及其他大分子和小分子化合物杂质。
2.如何将酶从粗提液只分离纯化？
要在许多蛋白质的混合物中分离出所需要的酶蛋白，目前常用的方法有盐析法，往层析法，薄膜超滤法，亲和层析法，电泳法等。在大体积的提取液中一般先采用硫酸铵分级盐析沉淀。盐析法是提纯酶使用最早的方法之一，迄今仍广泛使用，而且在高浓度的盐溶液中酶蛋白不易变性而失去活性，利于工作在室温中进行。不同蛋白质在高浓度的盐溶液中溶解度有不同程度的降低，盐析法就是利用这一性质，将不同性质的蛋白质分离，选择合适饱和度的硫酸铵，使沉淀的蛋白质的酶活性最大。大多数酶的活性存在于35梍45%和45梍55%饱和度硫酸铵沉淀的部分，但也有存在于65梍80%饱和度的（如花椰菜根的过氧化物酶）。沉淀的蛋白质经离心后收集之，再溶于少量缓冲溶液中，经透析或凝胶柱过滤，以除去硫酸铵及其他小分子杂质，然后再经过柱层析分离。由于吸附剂的不同，又有吸附柱层析、离子交换柱层析和凝胶过滤柱层析等。对于不同的支持物采用的洗脱方法也不同，分子筛类型凝胶过滤柱层析，洗脱液只要用一定浓度的缓冲液就可以了，亦即等浓度洗脱。对于吸附柱和离子交换柱层析，往往要采用浓度梯度溶液进行洗脱，最方便的是线性梯度浓度，当然用非线性梯度会得到更好的分离效果。柱层析一般都需要自动收集仪，如果能配用蛋白质检测仪就更好了。目前柱层析和硫酸铵分级沉淀一样，已经成为一种常规的酶的分离提纯的步骤之一了。
近年来纯化酶常用的一种有效方法为亲和层析。主要利用酶和底物、抑制剂或辅酶具有一定的结合能力，这一性质即可用来分离、提纯酶。首先选择一支持物，如琼脂糖（Sepharose）将底物、竞争性抑制剂或辅酶，以共价键的形式连接到支持物上，然后把含有酶的溶液，流过装有专一性底物、竞争抑制剂或辅酶的层析柱，酶即被保留在支持物上，再经过充分洗涤除去未被吸附的杂质，然后用含有一定浓度的底物或竞争性抑制剂或辅酶的缓冲液，进行竞争性洗脱。如果亲和剂选择合适，往往能得到较高纯度的酶，是酶分离、纯化中既方便又最有效的一种方法。
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（三）酶活力的测定
酶的活力表现为催化某一反应的速度，反应速度越大，酶的活力也越大，酶催化的反应速度可以用单位时间内底物的消耗量或产物的积累量来表示。由于酶的催化作用和周围环境的关系十分密切，环境的温度、pH、离子强度等都对酶的活力有很大的影响，因此测定酶活力时应该使这些条件保持恒定。
酶活力的大小常以每mg酶蛋白每分钟所分解的底物量（或生成的产物量）μmol数表示之。测定酶活性的方法很多，常因反应的底物和产物的性质不同可选用不同的方法，应用最广泛的是比色法或分光光度法。凡反应系统中的化合物在紫外区或可见光区有吸收峰的都可以用这种方法进行测定。如果酶催化的是一需氧反应，如氧化酶，则可用测压法或氧电极法。如果催化的反应系统中需要ATP或产生ATP，如一些激酶；或是有NAD存在，如一些脱氢酶和氧化还原酶；或者反应产生H2O2，如一些氧化酶，这些酶的活性可以用生物发光或化学发光方法进行测定。总之，测定酶活性的方法很多，应根据具体情况选择合适的方法。
三、材料、仪器与试剂
要求用硫酸铵分级沉淀部分纯化过氧化物酶。
（一）、材料：花椰菜根
（二）、仪器（仪器的选择在实验开始前由学生在预习报告中提出方案后教师审定）
冰冻离心机；751型分光光度计；电磁搅拌器；组织捣碎机；天平；量筒；移液管；烧杯；透析袋。
（三）、试剂（试剂的选择在实验开始前由学生在预习报告中提出方案后教师审定后并配制）
PVPP；硫酸铵；0.02mol/L KH2PO4溶液；0.lmol/L 磷酸钾缓冲液，PH6.0。
四、实验操作
(1)酶的提取：取花椰菜根（或其他植物材料）用自来水洗净，吸干水分，称得鲜重，按每g5ml提取溶液，加入预冷的0.02mol/L KH2PO4溶液，加入材料鲜重10%PVPP（预先经过纯化，用蒸馏水吸胀）。在预冷的组织捣碎机中搅成匀浆。匀浆倒在烧杯中，于冰箱中浸提1小时，用4层纱布或尼龙布袋过滤，滤液于18000r/min冷冻离心15分钟，弃去沉淀，上清液即为酶的粗提取液。
(2)硫酸铵分级沉淀：用量筒量得酶液的体积，吸取5ml留作酶活性及蛋白质含量分析，保存在冰箱中，其余酶液加入固体硫酸铵，使达35%饱和度（参阅附表8），加硫酸铵时要缓慢，以避免造成局部浓度过高，在电磁搅拌器上边搅拌边加入。然后置冰箱中半小时，离心如上。分别收集上清液和沉淀，上清液中再加入硫酸铵使达65%饱和度，再离心，收集沉淀和上清液。按这样的方法分别收集0梍35%、35梍65%、65梍80%、80梍100%饱和度硫酸铵沉淀。每部分沉淀分别复溶于1/20原始提取液体积的0.02mol/L KH2PO4溶液中，装入透析袋中，用大量KH2PO4溶液（2000ml）在冰箱中进行透析过夜，其间更换KH2PO4溶液约4次，直至无SO42-析出为止（用BaCl2溶液检查）。透析完毕后，分别量得适量体积，保存于冰箱中备用。
(3)蛋白质含量的测定：将原提取液及经硫酸铵分级沉淀得到的各分部溶液，用Folin试剂或考玛斯蓝G—250（参阅实验56）测定蛋白质含量，以牛血清蛋白作标准。
(4)酶活性的测定：以愈创木酚为底物测定酶活性（参阅实验49）。
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