病原性球菌的检查（一）
实验目的：
1．了解病原性球菌的检查程序。
2．掌握细菌涂抹标本制备和革兰氏染色法。
3．掌握病原性球菌的形态和分离培养法。
实验材料：
病原性球菌的形态、脓汁标本、革兰氏染色液、普通平板、血平板、玻片、接种环、酒精灯、光学显微镜、香柏油、吸水纸、擦镜纸、标记笔。
实验内容：
一、病原性球菌的检查程序
病原性球菌常引起化脓性疾病，分离用标本多采用脓、痰液，但也可从分泌物、血液及穿刺液中取材。
1、标本采集
（1）脓液：用无菌棉拭挑取患部深处脓液或分泌物，放入无菌试管内。
（2）痰液：用消毒过的容器收集病人痰液，以无菌棉拭挑取浓稠痰块，放入无菌试管。
（3）咽部分泌物：嘱病人张开口，用压舌板轻压舌根部，以无菌棉拭从鼻咽部位擦拭取材，然后将其放入无菌试管。
（4）血液：高热、败血症患者作血液检样时，最好在发热时，抗菌药物治疗前采取，这时培养阳性率最高。取血3~5毫升，立即以无菌手续注入30~50毫升（使血与培养基之比约等于1∶10）的葡萄糖酚红肉汤增菌培养基中。
（5）脑脊液：对疑患流脑的患者作腰椎穿刺取脑脊液（CSF），脑脊液取出后应盛于无菌容器内，立即送检。
（6）尿道、阴道分泌物：对淋病可疑患者，男性可从尿道取材，取材时应进入尿道1~2cm，如刚排尿，应等待1小时左右。女性则可从宫颈口取分泌物，当插入宫颈口后应稍等片刻，再旋转1~2分钟拿出，取材应立即送检，不可放置冰箱。
2、分离与鉴定
待检标本可直接作涂片染色检查鉴定，必要时可作分离培养及生化反应，致病性鉴定。常见致病性球菌的检查程序如下。
二、涂片染色镜检
（一）涂抹标本制备
方法：
1、涂片：取洁净的载玻片一张，用蜡笔标记，接种环灭菌后，以接种环取浓汁标本1-2环，置于玻片的中央，涂成直径约1cm的均匀薄膜涂片。如用固体培养物，须先加生理盐水，再将细菌少许与生理盐水混匀。
2、干燥：涂片最好在室温下自然干燥，必要时可将涂片膜面向上，小心间断地在弱火高处略烘，以助水分蒸发，但切勿紧靠火焰，以免涂膜烤枯，染色后难以检测。
3、固定：涂片干燥后，手持玻片一端（涂膜面向上）在酒精灯上快速地来回通过三次，共约2~3秒钟，注意温度不可太高，以玻片涂膜的反面触及皮肤觉烫而尚能忍受为度。固定的目的一是杀死细菌；二是使菌体与玻片粘附较牢，在染色时不致被染液和水冲掉；三是使菌体蛋白变性易着色（见图14~2）
二）革兰氏染色法
革半氏染色法（Gramstain）是丹麦细菌学家革兰（Christain Gram）于1884年发明的，至今已逾百年，但仍在广泛使用，是细菌学中最为经典的染色法。其基本过程是标本经固定后，先用结晶紫初染，再用革兰氏碘液媒染，然后用95%酒精脱色，最后用石炭酸复红稀释液复染。此法可将细菌染成两大类：不被酒精脱色仍保留紫色的为革兰氏阳性菌，被酒精脱色后复染成红色的为革兰氏阴性菌。
1、原理：革兰氏染色法的原理尚不完全清楚，主要有三种学说：
等电学说：革兰氏阳性菌等电点（Ph2~3）比革兰氏阴性菌（Ph4~5）低，一般染色时染液的酸碱度在Ph7.0左右，电离后阳性菌带的负电荷比阴性菌多，因此与带正电荷的结晶紫染料结合牢固，不易脱色。
通透性学说：革兰氏阳性菌细胞壁结构比较致密，肽聚糖层厚，脂质含量少，乙醇不易透入，反而可使细胞壁脱水而形成一道屏障，阻止染料向细胞外渗。革兰氏阴性细菌细胞壁疏松，肽聚糖层很薄，而外膜、脂蛋白、脂多糖均含有大量脂质，易被乙醇溶解，致使细胞壁通透性增高，细胞内的结晶紫-碘复合物容易被乙醇溶解而脱出。
化学学说：革兰氏阳性菌细胞内含有某种特殊化学成分，一般认为是核糖核酸镁盐与多糖的复合物，它和染料-媒染剂复合物相互结合，使已着色的细菌不易脱色。
2、革兰氏染色液的配制：①结晶紫染液：结晶紫14.0g，溶于95%酒精100ml中，制成结晶紫酒精饱和液。取出此饱和液20ml与1%草酸铵水溶液80ml混匀。
②碘液：先将碘化钾2.0溶于约2ml蒸馏水中，再加碘片1.0g，略加振摇，待碘片完全溶解后，再加蒸馏水至总量为300ml。
③稀释石炭酸复红染液：取碱性复红10.0g[或碱性复红（新）4.0g]溶于95%酒精100ml中，配成碱性复红酒精饱和液；取此饱和液10ml与5%石炭酸水溶液90ml混匀，配成石炭酸复红原液；取此原液10ml加入蒸馏水90ml中混匀，即成稀释石炭酸复红染液。
3方法：
①初染：在已固定的细菌涂片上滴加结晶紫染液数滴室温作用一分钟后，用细流水轻轻冲洗。
②媒染：滴加媒染剂碘液数滴，室温作用一分钟，用细流水冲洗。
③脱色：滴加95%酒精数滴，轻轻摇动玻片几秒钟，使均匀脱色，然后斜持玻片，使脱掉的染料随酒精流去，再滴加酒精，直到流下的酒精无色或稍淡紫色为止（约需30s），立即用细流水将酒精冲掉。
④复染：滴加稀释石炭酸复红液复染约30秒钟后用细流水冲洗。
⑤镜检：标本染色后，凉干，滴香柏油，用油镜观察，革兰氏阳性菌染成紫色，革兰氏阴性菌染成红色。
三、平板划线接种法（分离培养法）见细菌分离与培养。
病原性球菌检查（二）
实验目的
1掌握病原性球菌培养物性状。
2掌握血浆凝固酶试验原理方法。
3掌握密集接种法，熟悉药物（如抗生素）抑菌杀菌原理并了解纸片法、试管法的试验方法及应用。
实验材料
1、菌种：金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌6~8小时肉汤培养物。
2、培养基：普通琼脂平板、肉汤培养基。
3、药品：青霉素溶液（50u/ml）、抗生素滤纸片。
4、器具：恒温箱、接种环、酒精灯、试管、无菌棉拭、无菌小镊子、无菌吸管、玻片、血浆。
实验内容
一、病原性球菌的培养物观察
肉眼观察葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌在血琼脂平板上的生长情况及脑膜炎球菌在巧克力（色）琼脂平板上的生长情况，比较菌落的形态特征。
（1）葡萄球菌：在血琼脂平板上培养18~24小时，形成圆表凸起，表面光滑、湿润、边缘整齐，菌落不透明。金黄色葡萄球菌金黄色，可产生透明溶血环；表皮葡萄球菌白色、无溶血环，腐生葡萄球菌白色或柠檬色，无溶血环。
（2）链球菌：在血琼脂平板上培养18~24小时，形成灰白色、圆形凸起、半透明或不透明的细小菌落。甲型溶血性链球菌不完全溶血，在菌落周围形成草绿色溶血环，乙型溶血性链球菌完全溶血、形成透明溶血环，丙型链球菌不发生形成圆形、光滑隆起透明似露珠的菌落。在血琼脂平板上不发生溶血溶血、无溶血环。
（3）肺炎球菌：血琼脂平板上培养18~24小时，形成细小、灰白色、扁平、半透明的菌落，周围有草绿色溶血环，其与甲型溶血性链球菌相似，培养2~3天后，因菌体发生自溶，菌落中央下陷呈“脐状”。
（4）脑膜炎球菌：在巧克力（色）琼脂平板上加5%CO237℃培养24小时，
形成圆形光滑隆起透明似露珠的菌落，无溶血环。
二、血浆凝固酶试验
1、原理
致病性葡萄球菌能产生血浆凝固酶，使人或动物血浆发生凝固，因此，测定血浆凝固酶的有无是鉴定葡萄球菌致病性的重要依据。
2、方法及结果
（1） 玻片法：
①取干净玻片一块，用记号笔将玻片划成两格，其中一格加2接种环的生理盐水，另一格加1：2人血浆（或免血浆）1接种环。
②用接种环取上次培养物葡萄球菌之菌落少许在生理盐水内研磨成细菌悬液，然后取此悬液1环与血浆混匀。
③5分钟以内观察结果，若有凝块出现，即为阳性；若无凝块出现，则为阴性。
（2） 试管法：
①按表24-1加入1：4血浆及葡萄球菌肉汤培养液。
②将各管置37℃水浴中，每隔30分钟观察一次结果。
③在3小时内，若第一管及第二管出现凝固，而第三管不出现凝固则为阳性。
表24-1 血浆凝固酶试验（试管法）
试管
血浆（1：4）
待检葡萄球菌肉汤培养物
金黄色葡萄球菌肉汤培养物
肉汤
结果
1
0.5ml
0.5ml
—
—
2
0.5ml
—
0.5ml
—
3
0.5ml
—
—
0.5ml
三、药物敏感性试验
[实验原理]
治疗细菌感染的药物如磺胺类、异烟肼、抗生素等杀菌具有抑菌和杀菌作用，其作用机制主要是干扰细菌的代谢，阻碍和影响细菌细胞壁的合成、膜的通透性及核酸和蛋白质的生物合成，不同的细菌种类或菌株，对同一药物的敏感性不同，因此测定病原菌对抗菌类药物的敏感性，对于合理用药和提高临床疗效具有重要意义。本实验通过两种方法测定细菌对抗生素的敏感程序。
[内容与方法]
一、纸片法
1、密集接种法接种细菌：用无菌接种环挑取已培养好的金黄色葡萄球菌培养物少许，先在平板琼脂表面中央划一条线，垂直该线作平行密集划线，划满平板。再将平板转动90度，作平行密集划线，划满平板。
2、用无菌注射针头挑取抗生素（青霉素、链霉素、红霉素、庆大霉素、卡那霉素等）滤纸片，贴在平板琼脂表面。滤纸片之间距离应基本相等，一般每个平板贴四到五个滤纸片为宜。注意每次取滤纸片之前，针头须烧灼灭菌冷却。
3、将平板置37℃温箱培养24小时后取出观察滤纸片周围的抑菌圈（见图20~1），用尺子测量其直径并对照细菌对抗生素敏感度判断表做出结果判断。
二、试管法
1、金黄色葡萄球菌菌液制备
取金黄色葡萄球菌6~8小时肉汤培养物0.1ml加于2ml肉汤培养基中，置37℃温箱培养6~8小时后备用。
2、方法
（1）取10支无菌小试管标号后，除第一管外其它每管加入肉汤培养基1ml。
（2）在第一、二管中各加入青霉素（50u/ml）溶液1ml，混匀。
（3）从第二管中吸取1ml加入第三管中，混匀，然后依此法加样稀释至第九管，再从第九管中抽取1ml弃去。第十管不加青霉素作为对照管。
（4）于每管中加入金黄色葡萄球菌菌液各0.1ml，混匀。
（5）置37℃温箱培养24小时后观察结果，以培养基混浊程度来判断细菌对青霉素的敏感程度，最高稀释度的抗菌药物仍能抑制细菌生长者为最低抑菌浓度（MIC）可用单位/ml表示之。
常用药敏试验纸片判断标准与其相应的MIC近似值
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