基因诊断的概念、常用技术与应用
基因诊断的概念
一、基本概念：
1．人类的绝大多数疾病都与基因有关，基因变异引起疾病两种类型：
1) 内源基因变异：由于先天遗传和后天内外环境因素的影响，人类的基因结构及表达的各个环节都可发生异常，从而导致疾病。分基因结构突变和表达异常。
2) 外源基因的入侵：各种病原体感染人体后，其特异的基因被带入人体并在体内增殖引起各种疾病。基因改变引起各种表型改变，从而引起疾病，从基因水平探测分析病因和疾病的发病机制，并采用针对性的手段矫正疾病是近年基础和临床的方向。
２．基因诊断：利用现代生物学和分子遗传学的技术方法，直接检测基因结构及表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。
二、基因诊断的特点：
1．以基因做检查材料和检查目标针对性强；
2．分子杂交选用特定基因序列作探针，故特异性强；
3．分子杂交和PCR具有放大效应，故有较大的灵敏度；
4．适用性强，诊断范围广。
基因诊断的常用技术
一、核酸分子杂交：
核酸杂交是从核酸分子混合液中检测特定大小的核酸分子的传统方法。其原理是核酸变性和复性理论。即双链的核酸分子在某些理化因素作用下双链解开，而在条件恢复后又可依碱基配对规律形成双链结构。杂交通常在一支持膜上进行，因此又称为核酸印迹杂交。根据检测样品的不同又被分为DNA印迹杂交（Southern blot hybridization ）和RNA印迹杂交（Northern blot hybridization）。
（一）核酸分子杂交的基本过程：
①．DNA或RNA的制备：将待测样品用一定方法提取DNA或RNA。
②．制备探针；
③．杂交；
④．检测。
1．DNA或RNA的制备：将待测样品用一定方法提取DNA或RNA。
2．基因探针的概念：
① 基因探针（probe）就是一段与目的基因或DNA互补的特异核苷酸序列，它可以包括整个基因，也可以仅仅是/基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之转录而来的RNA。
② 探针的来源：
DNA探针根据其来源有3种：一种来自基因组中有关的基因本身，称为基因组探针（genomic probe）；另一种是从相应的基因转录获得了mRNA，再通过逆转录得到的探针，称为cDNA探针（cDNA probe）。与基因组探针不同的是，cDNA探针不含有内含子序列。此外，还可在体外人工合成碱基数不多的与基因序列互补的DNA片段，称为寡核苷酸探针。
③ 探针的制备：
进行分子突变需要大量的探针拷贝，后者一般是通过分子克隆（molecular cloning）获得的。克隆是指用无性繁殖方法获得同一个体、细胞或分子的大量复制品。当制备基因组DNA探针进，应先制备基因组文库，即把基因组DNA打断，或用限制性酶作不完全水解，得到许多大小不等的随机片段，将这些片段体外重组到运载体（噬菌体、质粒等）中去，再将后者转染适当的宿主细胞如大肠杆菌，这时在固体培养基上可以得到许多携带有不同DNA片段的克隆噬菌斑，通过原位杂交，从中可筛出含有目的基因片段的克隆，然后通过细胞扩增，制备出大量的探针。
为了制备cDNA 探针，首先需分离纯化相应mRNA，这从含有大量mRNA的组织、细胞中比较容易做到，如从造血细胞中制备α或β珠蛋白mRNA。有了mRNA作模板后，在逆转录酶的作用下，就可以合成与之互补的DNA(即cDNA)，cDNA与待测基因的编码区有完全相同的碱基顺序，但内含子已在加工过程中切除。
寡核苷酸探针是人工合成的，与已知基因DNA互补的，长度可从十几到几十个核苷酸的片段。如仅知蛋白质的氨基酸顺序量，也可以按氨基酸的密码推导出核苷酸序列，并用化学方法合成。
④ 探针的标记：
为了确定探针是否与相应的基因组DNA杂交，有必要对探针加以标记，以便在结合部位获得可识别的信号，通常采用放射性同位素32P标记探针的某种核苷酸α磷酸基。但近年来已发展了一些用非同位素如生物素、地高辛配体，荧光素等作为标记物的方法。但都不及同位素敏感。非同位素标记的优点是保存时间较长，而且避免了同位素的污染。最常用的探针标记法是缺口平移法(nick translation)。
a．缺口平移标记法粗线示标记部分：
首先用适当浓度的DNA酶Ⅰ（DNAseⅠ）在探针DNA双链上造成缺口，然后再借助于DNA聚合酶Ⅰ（DNA poly merasⅠ）的5’→3’的外切酶活性，切去带有5’磷酸的核苷酸；同时又利用该酶的5’→3’聚酶活性，使32P标记的互补核苷酸补入缺口，DNA聚合酶Ⅰ的这两种活性的交替作用，使缺口不断向3’的方向移动，同时DNA链上的核苷酸不断为32P标记的核苷酸所取代。
b．随机引物法：
探针的标记也可以采用随机引物法，即向变性的探针溶液加入6个核苷酸的随机DNA小片段，作为引物，当后者与单链DNA互补结合后，按碱基互补原则不断在其3’OH端添加同位素标记的单核苷酸，这样也可以获得比放射性很高的DNA探针。
3．杂交：
首先要进行预杂交，即用非特异的核酸溶液封闭膜上的非特异性结合位点。由于转印在膜上的核酸分子已经是变性的分子，所以杂交过程中只需变性标记好的探针，然后再让探针与膜上单链核酸在特定的温度下反应，结合成双链，然后洗去未结合的探针分子即可。
4．检测：
检测的方法依标记探针的方法而异。用放射性同位素标记的探针需要用放射自显影来检测其在膜上的位置；而如果是用生物素等非同位素方法标记的探针则需要用相应的免疫组织化学的方法进行检测。
（二） 以核酸杂交为基础的基因诊断技术：
限制性核酸内切酶（restriction endonuclease），又简称限制酶或内切酶。它们是基因工程和基因诊断重要的一类工具酶。它们的发现和应用为从基因组中分离目的基因提供了必要的手段。限制酶能特异地识别和切割特异的核苷酸序列，将双链DNA切成较小的片段。酶切后目的基因可能完整地或部分地保存于某一DNA片段上，并被分离出来。
1．限制性片段长度多态性分析法(RFLP)：
由于限制酶的特异性，如果识别位点的碱基发生了改变，限制酶将不再能切割；同样，碱基的改变也可能导致出现新的酶切位点。在人类基因组中，这两种情况是十分常见的，而切点的消失或出现将影响获得的DNA片段的长度， 表现为限制性片段长度多态性 （RFLP），这在基因的连锁诊断中具有极重要的意义。 RFLP反映了常见的个体间DNA核苷酸的可遗传性变异，它按照孟德尔方式遗传。即子代的特异性RFLP片段均能从亲代中找到来源。因此RFLP可作为遗传疾病和遗传倾向性疾病的有效遗传标志用于相关疾病的基因诊断。
2．限制性核酸内切酶酶谱分析法：
这种方法对于点突变非常有效。由于碱基的改变就可能引起酶切部位的改变，所以就可能引起DNA片段电泳图谱的改变。最常见的例子就是镰刀型贫血。
3．等位基因特异寡核苷酸探针杂交法：
若疾病的基因突变序列已知，则可人工合成这段特异性的寡核苷酸，同时合成一段正常序列的寡核苷酸。用2种探针与检测样品杂交，若只能与突变探针杂交则为突变纯合子，只能与正常探针杂交则正常，与两者都可杂交则为突变杂合子；两者均不能杂交则可能是新的突变。
4．荧光原位杂交法：
用生物素、地高辛或荧光素等标记的探针与细胞或染色体中的DNA杂交，然后在荧光显微镜下观察或照相，便可对杂交信号进行定位。用多色荧光原位杂交可同时检测多个可能突变区的缺失情况。
5．比较基因组杂交：
提取患者基因组DNA和正常人基因组DNA，用切口平移法分别标上不同的荧光制备探针，然后与正常人外周血白细胞的有丝分裂中期染色体进行原位抑制杂交。杂交后的荧光信号通过计算机便可知患者基因组中的增加或缺失区域。
6．基因芯片：
基因芯片指利用微点阵技术，将探针以高密度点阵的形式按一定的顺序固定排列在一厘米的硅片上；另一方面将待测基因标记上特异的荧光物质。最后用激光共聚焦显微镜和计算机扫描系统对芯片进行扫描分析。
非典病毒基因芯片：
我国科研人员5月8日研制出SARS病毒全基因组芯片检测系统。全基因组芯片覆盖了病毒基因组的全部序列，可在检测病毒的同时监测病毒基因组的变化，为分析世界各地分离株之间的差异、病毒在传播过程中可能发生的变异以及追索病毒来源提供了新的思路和方法。
二、聚合酶链反应（PCR）：
1．核酸杂交反应是一对一的反应，即膜上有一个被检测分子时，相应就有一个标记的探针分子与它杂交。所以整个实验敏感性主要取决于标记探针的质量和杂交后的检测方法。在优化的条件下，核酸杂交可检测到pg水平的靶分子，约相当于106个分子。但是，在许多临床情况下，即无法得到这样的样品量。这时可以用聚合酶链反应来扩增靶分子以特异性地增加靶分子量，达到提高敏感性的目的。
2．聚合酶链反应（polymerase chain reaction ，PCR）：
PCR的反应本身是在同一试管内利用DNA聚合酶催化的反应反复进行同一段DNA片段的合成。聚合酶反应的模板是待检测核酸分子：DNA可直接用于反应，而RNA则需要用反转录酶反转录成为cDNA，然后用作聚合酶反应的模板。反应的引物有两条，分别位于待扩增DNA片段的两端，可启动相对方向的DNA合成。这样从一个模板分子起始的话，经过n次聚合酶反应后就可以合成2 n个模板分子。所以从很小时的样品即有可能扩增出电泳后肉眼可见的产物。
3．PCR反应：
模板（待测 的cDNA或RNA）；
底物（dATP，dGTP，dCTP，dTTP）；
引物 ；
TaqDNA聚合酶， 反应温度（75-85 ℃ ）；
变性：95℃；
退火：55℃；
聚合：72℃；
检测：电泳或核酸杂交。
4．以PCR为基础的基因诊断技术：
（1）巢式PCR：先以一对外引物进行常规PCR，取一部分扩增产物为模板，用另一对内引物进行扩增反应，提高灵敏度和特异性。
（2）多重PCR：在同一PCR反应体系中加多对引物进行扩增反应的方法叫多重PCR。这种方法可对某一特定的基因的不同的区域进行缺失诊断。
（3）逆转录PCR：这种PCR的起始模板是RNA，先以 RNA为模板通过逆转录 反应合成，再以cDNA为模板合成双链cDNA，在此基础上再进行PCR。由此可见，RT-PCR在基因表达研究和对RNA病毒的基因诊断中具有特殊作用。
（4）荧光定量PCR：本方法通过对照基因的扩增或对引物进行荧光标记，结合一定的仪器可以对PCR产物进行定量。
（5）联合PCR技术。
三、核酸序列分析法：
核酸序列分析法是最确切的基因诊断分析法，它通过测定碱基排列序列而发现DNA的具体变异情况。
核酸序列分析法有两种：化学裂解法和双脱氧核苷酸末端终止法。
基因诊断的应用
1．病原生物的侵入：一般侵入体内的病原生物可通过显微镜检查各免疫学方法进行诊断。但是，直接检测病原生物的遗传物质可以大大提高诊断的敏感性。此外，由于基因碱基配对原理的基因诊断可直接检测病原微生物的遗传物质，所以诊断的特异性也大为提高。目前，基因诊断已在病毒性肝炎，爱滋病等传染病的诊断中发挥了不可代替的作用。
2．遗传病：遗传病是指遗传物质（基因）的异常所导致的疾病，因此遗传病的诊断，最本质和最直接的是检测出异常的基因。
从受精卵开始，各人的基因组就已确定。因此，对遗传病高危妊娠，基因诊断可以在胎儿出生前进行，甚至早在胚胎着床前进行，这对于减少遗传病儿的出生具有重要价值，也是目前对大多数尚没有理想治疗方法的遗传病最有效的预防措施。对于已经出生的遗传病患者，特别是如亨廷顿舞蹈症等某些成年期才发病的患者，由于基因诊断可以在症状出现之前进行，因而能及早采取措施，避免疾病基因遗传给后代。
3．癌症：现在已经发现，癌细胞是由受伤的基因激活的，环境污染物、微生物、某些食品或药品等可能是造成基因损伤的根源。随着癌基因的发现和抗癌基因研究的进展，癌症是一类基因性疾病的理论已经成立。基因诊断癌症是根据DNA杂交原理，探测某种基因的存在与否、有无变异，区别变异基因属良性或恶性，从而达到诊断癌症的目的。基因诊断癌症准确率高，甚至对某些人表现出患癌倾向性都能作出预测。
4．器官组织移植：器官移植（包括骨髓移植）的主要难题是如何解决机体对移植物的排斥反应。理想的方法是进行术前组织配型。基因诊断技术能够分析和显示基因型，更好地完成组织配型，从而提高了器官移植的成功率。
5．其它：
DNA指纹
个体识别
亲子关系识别
法医物证
非典型肺炎
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