PCR片段拼接的SOE和SDL方法-试验方案

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PCR片段拼接的SOE和SDL方法
点击： 作者：51protocol收集 来源： 日期：2007-06-02 本站论坛

　　PCR技术（多聚酶链式反应）是现代分子生物学的一个巨大突破，它能在体外迅速、大量、灵敏地扩增基因片段。可是，经PCR技术扩增的大量相关基因片段如何能有效拼接，却是一个很值行探讨的问题。传统的方法是引入限制性内切酶位点，这不但操作繁杂，而有时为了构建限性位点还会影响解读三联密码的正确性。本介绍两种基因拼接的新方法，即SOE和SDL法，就能巧妙地解决这个问题。

SOE法

　　1989年，Horton等人提出了SOE法（Gene splicing by over lap extension），即通过复制时DNA链的交错延伸不实现基因拼接。本法可分四步进行。

　　（1）引物设计：引物a和d是常规引物；b的左半段为常规引物，右半段为基因Ⅱ的引物序列；c同理；则b和c的部分碱基可互补配对。　　（2）基因I、Ⅱ分别扩增，产物相应为片段A、B和C、D。　　（3）两种产物混合，经变性及退火处理，A链和D链部分碱基互补配对，成杂交链。　　（4）在DNApolymeraseI作用下，A和D链互为引物和模板，合成出A'D'链，即为基因I 和基因Ⅱ的接接产物。若在引物中引入突变的碱基序列，则在接接产物中，将按预先设计要求出现定点突变。 SDL法　　1991年下半年，Lebedenko等人提出SDL方法（Gene splicing by directed liga- tion），即直接拼接法，它在SOE法基础上又有新的突破。本法的要点如下：　　（1）限制性内切酶，EcoRI核酸内切酶（或其它Ⅱs类限制性内切酶）能专一性识别 6bp的非回文序列，并能单向特异性地切断EcoRI识别的6bp以外的1

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