| SDS-PAGE实验操作 | | 点击： 作者： 来源： 时间： 2007-10-31 本站论坛 |
|  | 试剂：
1. 5x样品缓冲液（10ml）:0.6ml 1mol/L的Tris-HCl(pH6.8),5ml 50%甘油，2ml 10%的SDS，0.5ml巯基乙醇，1ml 1%溴酚蓝，0.9ml蒸馏水。可在4℃保存数周，或在－20℃保存数月。
2. 凝胶贮液：在通风橱中，称取丙烯酰胺30g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加重蒸水溶解后，定容到100ml。过滤后置棕色瓶中，4℃保存，一般可放置1个月。
3. pH8.9分离胶缓冲液： Tris 36.3g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH8.9，定容至100ml， 4℃保存。
4. pH6.7浓缩胶缓冲液： Tris 5.98g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH6.7，定容至100ml， 4℃保存。
5. TEMED（四乙基乙二胺）原液。
6. 10%过硫酸铵（用重蒸水新鲜配制）。
7. pH8.3 Tris-甘氨酸电极缓冲液：称取Tris 6.0g，甘氨酸28.8g，加蒸馏水约900ml，调pH8.3后，用蒸馏水定容至1000ml。置4℃保存，临用前稀释10倍。
8. 考马斯亮蓝G250染色液：称100mg考马斯亮蓝G250，溶于200ml蒸馏水中，慢慢加入7.5ml 70%的过氯酸，最后补足水到250ml，搅拌1小时，小孔滤纸过滤。
SDS-PAGE凝胶的有效分离范围
| 丙烯酰胺浓度（%） |
15 |
12.5 |
10 |
7.5 |
5.0 |
线性分离范围
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15-435kDa
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15-60kDa
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18-75kDa
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30-120 kDa
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60-212 kDa
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器材
电泳仪，电泳槽，水浴锅，摇床。
样品制备
将蛋白质样品与5X样品缓冲液（20ul＋5ul）在一个Eppendorf管中混合。放入100℃加热5－10min，离心，取上清点样。
电泳
1. 将玻璃板、样品梳、Spacer用洗涤剂洗净，用ddH2O冲洗数次，再用乙醇擦拭，晾干；
2. 将两块洗净的玻璃板之间加入Spacer，装好玻璃板；
3. 按如下体积配制10％分离胶8.0 ml，混匀；
ddH2O 3.0 ml
1.0 mol/LTris-HCl pH=8.8 2.1 ml
30% Acr-Bis 2.8 ml
10% SDS 80 ul
10%AP 56 ul
TEMED 6 ul
4. 向玻璃板间灌制分离胶，立即覆一层重蒸水，大约20 min后胶即可聚合；
5. 按如下体积配制6％浓缩胶3.0 ml，混匀；ddH2O 1.0 mol/LTris-HClpH=6.8 30%
将上层重蒸水倾去Acr-Bis
2.0 ml 400 ul 600 ul
10% SDS 10% AP TEMED
36ul 24ul 4ul
6. 滤纸吸干，灌制浓缩胶，插入样品梳；
7. 装好电泳系统，加入电极缓冲液，上样20 μl;
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