RNA凝胶电泳试验
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  • RNA凝胶电泳试验

  • 点击:    作者:   来源: 日期:2007-10-28    本站论坛
实验基本原理:
  RNA可以使用非变性或变性凝胶电泳进行检测。在非变性电泳中,可以分离混合物中不同分子量的RNA分子,凡是无法确定分子量。只有在变性情况下,RNA分子完全伸展,其泳动率才与分子量成正比。
  判断RNA提取物的完整性是进行电泳的主要目的之一。完整的未降解的RNA制品的电泳图谱应可清晰看到18s rRNA、28s rRNA、5s rRNA的三条带,且28s rRNA的亮度应为18s rRNA的两倍。

实验试剂:
1、 0.1%DEPC水:200ml双蒸去离子水加0.2mlDEPC焦炭酸、二乙酯混匀,室温放置过夜,高压灭菌。
2、 10x电泳缓冲液:吗啉代丙烷磺酸(MOPS)0.4mol/L(pH 7.0);NaAc 0.1mol/L;
  乙二胺四乙酸(EDTA) 10mmol/L;
3、 50mL变性琼脂糖凝胶(1%):10x电泳缓冲液5 mL;琼脂糖0.5 g;0.1%DEPC水36.5 mL;
  加热溶解,稍冷却,加入8.5 mL 37%甲醛。?
4、 上样缓冲液:50%甘油,1mmmol/LEDTA,0.4% 溴酚兰,0.4%二甲苯蓝。
5、 甲酰胺(去离子)。

操作步骤:
1、 将制胶用具用70%乙醇冲洗一遍,晾干备用。
2、 制胶:称取0.5g琼脂糖粉末,加入放有36.5mL的DEPC水的锥形瓶中,加热使琼脂糖完全溶解。稍冷却后加入5mL的10x电泳缓冲液、8.5mL的甲醛。然后在胶槽中灌制凝胶,插好梳子,水平放置待凝固后使用。
3、 加样:在一个洁净的小离心管中混合以下试剂:电泳缓冲液(10x)2μl、甲醛3.5mL、甲酰胺10mL、RNA样品3.5μl。混匀,置60℃保温10min,冰上速冷。加入3μl的上样缓冲液混匀,取适量加样于凝胶点样孔内。同时点RNA标准样品。
4、 电泳:打开电泳仪,稳压7.5V/cm电泳。
5、? 电泳结束后通过紫外透视仪观察。

注意事项:
  本实验中必须保持RNase污染以免RNA降解。所有试剂用DEPC水配制,用具也用DEPC水冲洗,并灭菌。

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