| 核酸蛋白转移电泳及杂交 | | 点击： 作者： 来源： 时间： 2007-04-09 本站论坛 |
|  | | 一、DNA Southern Blot及杂交
本技术可用于基因组DNA特定序列定位，尤其可分析某些基因的限制性内切酶长度多态性，对遗传性疾病的早期基因诊断、产前诊断或基因变异等方面的研究有应用价值，其过程包括：样品DNA内切酶水解、水解片断的琼脂糖凝胶电泳分离、分离后水解片断的转移(固定)、特异性DNA片断的分子杂交及放射自显影。
(一)样品DNA内切酶水解
限制性内切酶(RE)可裂解双链DNA，每种酶其特点是具有高度特异性的DNA裂解点和不同电离子强度的特殊反应条件。不同产品其反应条件不同，应根据说明书操作。单位(U)RE活性是在37℃ 1小时内能将1μg DNA所有特异性位点切断的酶用量。若用两种以上不同的内切酶，要注意RE的最适盐浓度，要由低向高逐级添加适量盐逐个进行DNA切割。
1、配液：10×限制性酶消化缓冲液
10×buffer O—无盐：100mmol/L Tris HCL pH7.4
1mg/mL BSA
100mmoL/L MgCL2
10mmol/L DTT(二硫苏糖醇)
10×bnffer L—低盐：缓冲液O
0.5mol/L Nacl
10×bnffer H—高盐：缓冲液O
1.0mol/L Nacl
2、操作步骤：
(1)将DNA(0.2～1.0μg)溶液加入EP管中,并加入适量H2O总体积为18μL，混匀。
(2)加入2mL 10×限制酶缓冲液，根据厂家建议的盐浓度选择不同的缓冲液。
(3)加1～2U限制性内切酶充分混合。
(4)37℃温育适当时间，时间需先进行预试验，摸索所需消化的时间，通常用琼脂糖凝胶电泳鉴定，酶解充分，各片断分子量从大到小分布均匀。
(5)加入0.5mol/L EDTA pH8.0使达到终浓度为10mmol/L终止反应。
(6)消化后的DNA直接进行琼脂糖电泳，方法同前，可用于分析或Southern Blot。
(二)Southern Blot及杂交。
将经电泳走在琼脂糖中的DNA变性、中和后，以毛细管作用在高盐缓冲液中转移至硝酸纤维膜上，再用放射性探针检测与之杂交的DNA。
1、配液：
(1)变性溶液：1.5mol/L Nacl 0.5mol/L NaoH
(2)中和溶液：200mL 20×SSC
100mL 1mol/L HCL
100mL 1mol/L Tris HCl pH8.0加水至500mL。
(3)20×SSC： 在800mlH2O中溶解175.3g Nacl和88.2g柠檬酸钠，加入数滴10mol/L NaoH调pH至7.0加水至1000ml，高压消毒灭菌。
(4)预杂交液：12.5mL 1mol K3 PO4 pH7.4
125mL 20×SSC
25mL 100×Denhardt’S溶液
5mL 5mg/mL鱼精DNA
250mL 100%去离子甲酰胺
82.5mL H2O(总体积为500mL)
(5)100×Denhardt’S液：10g聚蔗糖(Ficoll400)
10g聚乙烯吡咯烷硐
10g牛血清白蛋白(组分V)
加H2O至500ml
2、操作步骤(如图20-1)：
(1)内切酶消化的DNA，总体积为50uL，加入10uL加样缓冲液进行12-24琼脂糖电泳。
(2)用溴化乙锭染色，紫外灯下观察并照像，在胶的旁边放一尺子。
(3)将电泳胶取出，用以下各溶液浸泡处理，同时轻轻摇动：
500mL 0.2mol/L HCL 10分钟，水洗若干次
500mL变性液中浸泡15分钟×2
500mL中和溶液浸泡30分钟。
(4)剪一张硝酸纤维素膜，每边小于胶3mm。
(5)剪3～5层滤纸，大小每边比硝酸纤维膜小7mm，再剪一张滤纸，比胶的宽度长30～40cm，在一盘中加入数百毫升20×SSC，盘上搭一块玻璃，滤纸可从玻璃双侧浸到盘中的溶液。
(6)逐层放置滤纸、凝胶、硝酸纤维素膜，其上再铺滤纸及吸水纸，并加以重物，胶和硝酸纤维膜之间不可有气泡，转移24～36小时
(7)取出该膜，用圆珠笔标记方向，放入2×SSC中5分钟，用滤纸吸干,80℃烘烤2小时。
(8)将该转移膜放在塑料袋中，加入6～10mL预杂交液，排出气泡，封口，42℃ 3小时或过夜。
(9)将标记的DNA探针煮沸5分钟，立即冷却，加入杂交液中，浓度为5×105 CPM/ML。
(10)倒去预杂交液，加入含探针的杂交液封口，42℃ 6h或过夜。
(11)取出转移膜，按以下条件洗膜
1×SSC，0.1%SDS室温2×15分钟
0.25SSC，0.1%SDS,42℃ 2×15分钟，气中干燥。
(12)将杂交后的膜曝光于X光片，暗盒中放射自显影2～7天，-70℃。
(13)X片显影、定影，然后读片
结果分析：此杂交技术可以对基因结构进行分析。杂交阴性带的大小，分布规律及根据带条信号强度测量其含量。
二、RNA Northern Blot及杂交
此法是将RNA分子在变性琼脂糖凝胶中可相互分离，随后将RNA转移至硝酸纤维素滤膜上，用放射性标记的探针进行DNA-RNA杂交，此法是研究RNA(特别是mRNA)的主要方法之一，可测量RNA的含量和大小。
1、配液：Northern 预杂交液：12.5m 1mol/L K3PO4 pH7.4
125mL 20×SSC
25mL 100×Danhardt’s液
5mL 5mg/mL 鱼精DNA
250mL 100%去离子甲酰胺
加H2O 至500mL-20℃贮存
Northern 杂交液：500mL预杂交液加入标记探针及10%磷酸葡聚糖。
2、操作步骤：
(1)RNA变性电泳方法同前
(2)待溴酚兰走至胶的中部时，用水清洗胶数次，放置于500mL 10×SSC中浸泡45分钟，轻轻摇动。
(3)测量胶的大小，按下列顺序，从下向上为①横跨玻璃双侧的滤纸，双边可浸至20×SSC溶液；②胶；③硝酸纤维素滤膜；④亲和层吸纸；⑤吸水纸；⑥重物、转移4～6小时。
(4)取出滤膜80℃烘烤2小时。
(5)用6～10mL Northern预杂交液，42℃预杂交过夜。
(6)将已标记的探针煮沸，立即冷却，加入6～10mL Northern杂交液。
(7)去除预杂交液，加入含探针的杂交液，42℃，杂交过夜。
(8)按下列条件洗膜：1×SSC 0.1%SDS室温2×15分钟
0.25×SSC 0.1%SDS室温2×15分钟
(9)曝光于X光片暗盒中放射自显影1天。显影，定影，根据自显影条带的位置判定特定片断的位置和顺序，也可测含量。
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