②分离胶应有的pH值
在分离胶中要求甘氨酸有效迁移率（m
Gα
G）超过所有的蛋白质的有效迁移率。这样甘氨酸的泳动速度即超过所有蛋白质，使分离胶保持均一的pH及电位梯度，以便蛋白质样品在其中进行普通的电泳分离和分子筛分离（如图15-5C所示）。
血清中的前清蛋白在7.5%凝胶中的迁移率小于―0.5单位，则mGαG至少应为―5.0。即α= 1/3，按上述计算pH应为9.5。实际上Davis所用的配方中，分离胶的pH值为8.9。但在电泳分离时，根据实际测定证明与理论计算相符，实际上比原制备时的pH约高出半个pH单位，所以与要求的数值是符合的。
2．分子筛效应
分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径的分离胶时，受阻滞的程度不同，因此表现出不同的迁移率，即所谓分子筛效应。即使净电荷相似，也就是说自由迁移率相等的蛋白质分子，也会由于分子筛效应在分离胶中被分开。
此处分子筛效应是指样品通过一定孔径的凝胶时，小分子走在前面，大分子走在后面。而在柱层析方法中的分子筛作用，则是大分子通过凝胶颗粒之间的缝隙先流出，而小分子则通过凝胶颗粒内的孔道后流出。
3．电荷效应
蛋白质混合物在凝胶界面处被高度浓缩，堆积成层，形成一狭小的高浓度的蛋白质区，但由于每种蛋白质分子所载有效电荷不同，因而迁移率不同。承载有效电荷多的，泳动的快，反之则慢。因此各种蛋白质就以一定的顺序排列成一个一个的圆盘状。在进入分离胶中时，此种电荷效应仍起作用。
（二）聚丙烯酰胺凝胶的性能及制备原理
1．性能
聚丙烯酰胺凝胶的机械强度好，有弹性，透明，相对地化学稳定，对pH和温度变化较稳定，在很多溶剂中不溶，是非离子型的，没有吸附和电渗作用。原料成分要采用高纯度制品，通过改变浓度和交联度，可以控制孔径变动在极广泛的范围，并且制备凝胶的重复性好，由于纯度高及不溶性，因此还适于少量样品的制备，不致污染样品。
2．制备原理
聚丙烯酰胺是用丙烯酰胺（acrylamide，简称Acr）和交联剂甲叉双丙烯酰胺（N,N,N＇,N＇-methylene bisacrylamide，简称Bis）在催化剂的作用下聚合而成。它们的结构式见下页。
聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种：
（1）化学聚合：化学聚合的催化剂通常多采用过硫酸铵（ammonium persulfate，简称AP）或过硫酸钾，此外还需要一种脂肪族叔胺作为加速剂，最有效的加速剂为N,N,N＇,N＇-四甲基乙二胺（N,N,N＇,N＇-tetramethyl ethylenediamine，简称TEMED），其次为三乙醇胺及二甲氨基丙腈（3-dimethylaminopropionitrile，简称DMPN）。在叔胺的催化下，由过硫酸铵形成氧的自由基，后者又使单体形成自由基，从而引发聚合作用。叔胺要处于自由碱基状态下才有效。所以在低pH时，常会延迟聚合作用。分子氧阻止链的延长，妨碍聚合作用，一些金属离子也能抑制聚合。冷却可以使聚合速度变慢。通常控制这些因素使聚合在1小时内完成，以便使凝胶的性质稳定。
（2）光聚合：光聚合通常用核黄素为催化剂。不一定加TEMED即能聚合，但加入则可加速聚合。
光聚合通常需要有痕量氧存在，核黄素经光解形成无色基。后者被氧再氧化形成自由基，从而引发聚合作用。但过量的氧会阻止链长的增加，应该避免过量的氧存在。
光聚合通常用日光灯或普通钨丝灯泡作光源，直接日光或室内强散射光也可以。
用核黄素进行光聚合的优点是：①核黄素的用量很低（1毫克/100毫升）；②通过光照可以预定聚合时间，但光聚合的凝胶孔径较大，而且随时间延长而逐渐变小，不太稳定，所以用它制备大孔凝胶较适合。化学聚合的凝胶孔径较大，因而采用过硫酸铵-TEMED催化系统制备小孔凝胶（分离胶），而且制备的重复性好。
3．凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系
凝胶浓度与被分离物的分子量大小的关系，大致范围如表15-1。
聚丙烯酸胺：
常用的所谓标准凝胶是指浓度为7.5%的凝胶，大多数生物体内的蛋白质在此凝胶中电泳能得到满意的结果。当分析一个未知样品时，常常先用7.5%的标准凝胶或用4—10%的凝胶梯度来试测，而后选出适宜的凝胶浓度。
凝胶的机械性能、弹性是否适中是很重要的，胶太软易于断裂，尤其在制作板型电泳的薄片状凝胶时，太软很难操作。太硬则脆，也易折断。凝胶的透明度、粘着度是否合适也影响分离效果。凝胶的机械性能、弹性、透明度和粘着度取决于凝胶总浓度和Acr与Bis两者之比例。
凝胶密度或凝胶浓度，可以用二个字母T和C来定义。T代表丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺二个单体的总百分浓度。C代表总浓度T中交联剂Bis的百分浓度。Hjertern，S.推导出如下这个式子，用以计算凝胶的用量。
这里 为丙烯酰胺的量（g）
b为亚甲基双丙烯酰胺的量(g)
m为缓冲液体积（ml）
/b的值是有临界线的，如果 /b＜10，制成的凝胶脆而易碎，坚硬而不透明。如果 /b＞100，即使5%的丙烯酰胺也是糊状的，容易破碎。 /b的值接近30时，（其中丙烯酰胺的量必须＞3%），可以制成既有弹性又完全透明的凝胶。
Davis,B.J.在1964年，研究了丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺的浓度范围，分别为1.5—60%和0—0.626%之间的凝胶形成情况。他发现丙烯酰胺浓度＜2%，亚甲基双丙烯酰胺浓度＜0.5%，不发生聚合凝固作用。为了获得一种有弹性的凝胶，在增加丙烯酰胺浓度的同时，应适当减低亚甲基双丙烯酰胺的浓度。对于这个要求，Richards,E.C.等人提出了如下一个经验公式：
C=6.5―0.3T
浓度在5—20%范围内，可以应用这个式子容易地计算凝胶的组成用量。式中C可有1%的变化。
对于人血清蛋白质的分离，Brackenridge,C.J.等人，推导出了下面这个经验式，用以计算最适的凝胶浓度，以便获得最好的分辨率。
B=0.201―0.0112T
这里，B代表亚甲基双丙烯酰胺的百分浓度，T为二个单体总的百分浓度。
用于研究大分子核酸的凝胶多为大孔径凝胶，太软，不易操作，最好加入0.5%琼脂糖。有的在3%凝胶中加20%蔗糖，也可增加机械强度而又不影响孔径大小。
（三）几种染料的性能及染色原理
1．氨基黑10B（amino black 10B）
C
22H
13O
12N
6S
3Na
3 MW=715，λmax=620―630nm。氨基黑是酸性染料，其磺酸基与蛋白质反应构成复合盐。是最常用的蛋白质染料。但用氨基黑染SDS-蛋白质时效果不好。另外，氨基黑染不同蛋白质时的着色度不等，色调不一（有蓝、黑、棕等），作同一凝胶柱的扫描时误差较大，需要对各种蛋白质作出本身的蛋白质-染料量（吸收值）的标准曲线。
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