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圆盘电泳

点击： 作者： 来源： 时间： 2007-04-09 　本站论坛

原理
圆盘电泳即聚丙烯酰胺凝胶电泳。它是利用丙烯酰胺和双丙烯酰胺在催化剂的作用下聚合成大分子的凝胶物。它同时兼有分子筛和电泳效应。当样品通过凝胶进行电泳时，便可以根据其样品中各分子的电荷和分子量的不同而泳动出不同的区带。由于聚丙烯酰胺凝胶化学性质较琼脂稳定，很少带有侧基，在电泳过程中，吸附作用与电渗作用均小，所以该技术的分辨率均高于其它琼脂电泳技术。

材料与试剂
1．20％单体母液
丙烯酰胺（Aorylamide） 19.60g
双丙烯酰胺（N，N—methylene Bisaerylamide） 0.40g
H2O 加至 100.00ml
2．pH8.0 Tris—EDTA缓冲液
Tris（三羟基甲基氨基甲烷） 6.05g
EDTA（乙二胺四乙酸） 1.17g
H2O 加至 100.00ml
3．B—三甲基胺基丙腈液（B—DMPN）
（Dimethylaminopropionitrile），原液于4℃冰箱保存。
4．10％过硫酸铵溶液
过硫酸铵 0.50g
H2O 加至 5.00ml
现用现配或配后低温保存不超过一周。
5．0.025Mol/L pH9.0 硼酸缓冲液
硼酸 3.948g
硼砂 30.512g
H2O 加至 1000.0ml
使用时取该液90ml加H2O至1 440ml，即为电泳液。

操作方法
1．凝胶管的制备取20％单体母液3.60ml，Tris－EDTA缓冲液1.20ml，加蒸馏水7ml，混匀，再加入B－DMPN液0.05ml（约2滴），10％过硫酸铵溶液0.15ml（约5滴~6滴），混匀，倒入一端用橡皮薄膜封闭的小胶管内（注意不要产生气泡），上端留1ml空处，加蒸馏水至满，在灯光照耀下30min，使之聚合成凝胶。
2．样品处理取待测样品与对照样品各0.10ml，分别加0.5％溴麝香酚兰指示剂一小滴，再加25％蔗糖液0.10ml（约3小滴）。混合即可。
3．加样用毛细吸管吸弃胶管上的蒸馏水，缓缓加入已处理的样品于凝胶柱上，每种样品加一管，管的上端留出约0.50cm的空处。
4．电泳除去凝胶管下端的橡皮薄膜，将胶管装入电泳槽内，加入pH9.0的0.025mol/L硼酸缓冲液，液体必须没过胶管的两端。下端接正极，上端接负极，进行电泳。开始以1mA/管的电流，以后可以逐渐加至4mA/管，待指示剂电泳到离胶管下口约0.5cm时（一般约需40min），停止电泳。
5．剥胶取出胶管，用带有注射器的长针头插入胶管壁与凝胶柱之间注入蒸馏水以使凝胶脱出。
6．染色将剥出的凝胶柱浸泡于0.05％氨基黑10B溶液中10min~20min，用水冲洗，然后用7％的冰醋酸液脱色24h，中间换液数次，至背景无色为止，最后浸泡于7％的冰醋酸溶液中保存。

结果判定
与标准品比较，根据区带的位置进行定性检查。

注意事项
1．样品的离子强度、pH值尽可能与浓缩胶溶液相同，如含大量盐类时，应透析除盐。最适合的样品蛋白量是10μg～100μg，加入样品量要少，血清样品3μl～5μl，免疫球蛋白样品可加15μl～20μl。
2．凝胶柱面应平整，操作过程切勿产生气泡，否则电泳区带不整齐。
3．电泳中电流应保持稳定，避免电流强度过高，而产生大量的热使分离失败。
4．电泳开始，样品应于5min～10min内进入凝胶柱内为佳。
5．药品大部分有毒，应注意防护。

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