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  • 原位杂交与荧光原位杂交

  • 点击:    作者:   来源: 日期:2007-04-09    本站论坛

  7.其它杂交类型
  (1)固化探针杂交:该法较少使用,原理是使未标记固化探针通过杂交与靶RNA或DNA结合,漂洗后,用酶标抗DNA:RNA抗体或抗DNA:DNA抗体与杂交物结合。将乳胶颗粒收集,吸附到膜上后漂洗,加入底物显色并进行测定。探针浓度2μg/ml,80℃杂交,可在10~15min完成,检测的敏感性为5×108靶序列。
  (2)反向杂交:这个杂交类型是用标记的样品核酸与未标记的固化探针DNA杂交,故称为“反向杂交”。这种杂交方法的优点是在一次杂交反应中,可同时检测样品中几种核酸 。这种杂交方式主要用于进行中的核酸转录试验和多种病原微生物的检测。前者是在转录过程中标记RNA探针,后者可用光敏生物素制剂BPA标记样品核酸。
  (三)液相核酸分子杂交类型
  1.吸附杂交
  (1)HAP吸附杂交:羟基磷灰石(HAP)层析或吸附是液相杂交中最早使用的方法。在液相中杂交后,DNA:DNA杂交双链在低盐条件可特异地吸附到HAP上。通过离心使吸附有核酸双链的HAP沉淀,再用缓冲液离心漂洗几次HAP,然后将HAP置于计数器上进行放射性计数。
  (2)亲合吸附杂交:生物素标记DNA探针与溶液中过量的靶RNA杂交,杂交物吸附到酰化亲合素包被的固相支持物(如小球)上,用特异性抗DNA:RNA杂交物的酶标单克隆抗体与固相支持物上的杂交物反应,加入酶显色底物,这个系统可快速(2h)检测RNA。
  (3)磁珠吸附杂交:Gen – probe公司最近应用吖啶翁酯(acridinium ester)标记DNA探针,这种试剂可用更敏感的化学发光来检测。探针和靶杂交后,杂交物可特异地吸附在磁化的有孔小珠(阳离子磁化微球体上)。溶液中的磁性小珠可用磁铁吸出,经过简单的漂洗步骤,吸附探针的小珠可用化学发光测定。
  2.发光液相杂交
  (1)能量传递法:Heller等设计用两个紧接的探针,一个探针的一端用化学发光基团(供体)标记,另一个探针的一端用荧光物质标记,并且这两个探针靠得很近。两个靠得很近的探针用不同的物质标记(标记光发射),当探针与特异的靶杂交后,这些标记物靠得很近。一种标记物发射的光被另一种标记物吸收,并重新发出不同波长的光,调节 检测器使自动记录第二次发射光的波长。只有在两个探针分子靠得近时,才能产生受激发光,因此这种方法具有较好的特异性。
  (2)吖啶翁酯标记法:吖啶翁酯标记探针与靶核酸杂交后,未杂交的标记探针分子上的吖啶翁酯可以用专门的方法选择性除去,所以杂交探针的化学发光是与靶核酸的量成比例的。该法的缺点是检测的敏感度低(约1ng的靶核酸),仅适用于检测扩增的靶序列,如rRNA或PCR扩增产物。
  3.液相夹心杂交
  (1)亲合杂交:在靶核酸存在下,两个探针与靶杂交,形成夹心结构,杂交完成后,杂交物可移到新的管或凹孔中,在其中杂交物上的吸附探针可结合到固相支持物上,而杂交物上的检测探针可产生检测信号。用生物素标记吸附探针,用125I标记检测探针,这个系统的敏感性可检测出4×106靶分子。该试验保持了固相夹心杂交的高度特异性。
  (2)采用多组合成探针和化学发光检测:第一类探针是未标记的检测探针和液相吸附探针,它们有50个碱基长,其中含有30个细菌特异序列碱基和20个碱基的单链长尾;第二类探针是固相吸附探针,它可吸附在小珠或微孔板上。未标记检测探针的单链长尾用于结合扩增多个标记探针,液相吸附探针和靶杂交物从溶液中分离并固定在小珠或微板上,典型的试验可用25个不同的检测探针和10个不同的吸附探针。第一个标记检测探针上附着很多酶(碱性磷酸酶或过氧化物酶)可实现未标记检测探针的扩增。使用化学发光酶的底物比用显色反应酶的底物更敏感。这个杂交方法已用于乙肝病毒、沙眼衣原体、淋球菌以及质粒抗性的检测,敏感性达到能检测5×104双链DNA分子。
  4.复性速率液相分子杂交  这个方法的原理是细菌等原核生物的基因组DNA通常不包含重复顺序。它们在液相中复性(杂交)时,同源DNA比异源DNA的复性速度要快。同源程度越高,复性速率和杂交率越快。利用这个特点,可以通过分光光度计直接测定变性DNA在一定条件下的复性速率,进而用理论推导的数学公式来计算DNA-DNA之间的杂交(结合)度。


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