| 高效和液相色谱纯化小鼠腹水中单克隆抗体 | | 点击： 作者： 来源： 时间： 2007-11-11 本站论坛 |
|  | 从小鼠腹水中纯化mcab的方法有盐析、离子交换层析、凝胶过滤和亲合层析等。应用tsk deae-spw离子交换层析柱从小鼠腹水中纯化mcab不仅纯化速度快，回收率和得率高 ，而且保持良好的生物学活性。
原理
根据离子交换原理，将经硫酸铵粗提的含mcabγ球蛋白上样结合于层析柱上，通过增加洗 脱液中的离子强度，洗脱并收集蛋白峰。
试剂和器材
（1） tsk deae spw离子交换层析柱 （75mm×7.5mm,bio rad）
（2） 高效液相色谱仪（包括控制系统、溶剂传递系统、高压加压活门和紫外280nm监测系统）
（3） PBS，缓冲液a和b。
操作步骤
腹水离心10000 g,10min，除去细胞和杂质，在4℃下逐滴加入饱和硫酸铵溶液，使终浓度为40%饱和硫酸铵
↓搅拌20～30min
离心，沉淀用40%饱和硫酸铵洗涤2次后溶于PBS，对缓冲液a（pH8.5, 20mmol/l tris缓冲液）透析除盐
↓4℃过夜
用带有1000μl样品环的高压加样活门将透析后粗提物加样于经缓冲液a液平衡的tsk deae spw离子交换层析柱
↓
洗脱流速1ml/min
0～1min ：0→5%缓冲液b（20nmol/l tris, pH 8.5,含2.0 mol/l醋酸钠）
1～2 min( 线性梯度洗脱)：5→20%缓冲液b
20～22min：20→0%缓冲液b
↓
洗脱液用紫外280nm进行监测
↓
收集蛋白峰，进行含量、纯度和活性测定
注意事项
（1） 所用缓冲液和加样粗提物均需0.2μm滤膜过滤。
（2） 在本实验条件下，IgG1峰一般在线性梯度洗脱开始11-12min。但不同类和亚类抗体以及不同特异性mcab 的存留时间（retention time）有所差异。
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