| 抗体纯化－deae-sephadex a-50 柱层析法 | | 点击： 作者： 来源： 时间： 2007-11-11 本站论坛 |
|  | 原理：
deae-sephadex a-50（二乙氨基—乙基-葡萄糖凝胶a-50）为弱碱性阳离子交换剂。用NaOH将Cl-型转变为OH-型后，可吸附酸性蛋白。血清中的γ球蛋白属于中性蛋白（等电点为pH6.85～7.5），其余均属酸性蛋白。pH7.2～7.4的环境中，酸性蛋白均被deae- sephadex a-50吸附，只有γ球蛋白不被吸附。因此，通过柱层析，γ球蛋白便可在洗脱中先流出，而其他蛋白则被吸附在柱上，从而便可分离获得纯化的IgG。
试剂和器材
1. 试剂:
（1） 盐析提取的人γ球蛋白；
（2） 0.5N NaOH，0.5N HCl 2M NaCl，10％NaN3；
（3） DEAE-Sephadex A-50，聚乙二醇(PEG)；
（4） 0.1M, PH7.4 PB(配制见盐析部分)；
2. 器材:
（1） 层析玻璃柱(1.3×40cm)，滴定铁架，自由夹，螺旋夹，尼龙纱(200目)；
（2） 普通冰箱，751桮型紫外分光光度计，电导仪、抽滤装置(包括抽气机、干燥瓶、布氏漏斗、橡皮垫圈、抽滤瓶)，PH计；
（3） 透析袋、座标纸、滤纸、PH精密试纸；
（4） 量筒、烧杯、试管、吸管、滴管、灭菌小瓶等。
操作步骤
1. deae-sephadex a-50预处理
称deae-sephadex a-50（下称a-50）5g，悬于500ml蒸馏水内，1h后倾去上层细粒。按每克a-50加0.5mol/l naoh 15ml的比例，将a-50浸泡于0.5mol/lNaOH液中，搅匀，静置30min，装入布氏漏斗（垫有2层滤纸）中抽滤，并反复用蒸馏水抽洗至 pH呈中性；再以0.5mol/l HCl同上操作过程处理，最后以0.5mol/l NaOH 再处理一次。处理完后，将a-50浸泡于0.1mol/l pH7.4PB中过夜 。
2. 装柱
（1） 将层析柱垂直固定于滴定架上，柱底垫一圆形尼龙纱，出水口接一乳胶或塑料管并关闭开关。
（2） 将0.1mol/l ,pH7.4PB沿玻璃棒倒入柱中至1/4高度，再倒入经预处理并以同上缓冲液调成稀糊状的a-50。等a-50。等a-50凝胶沉降2～3cm高时，开启出水口螺旋夹，控制流速1ml/min，同时连续倒入糊状a-50凝胶至所需高度。
（3） 关闭出水口，待a-50凝胶完全沉降后，柱面放一圆形滤纸片，以橡皮塞塞紧柱上口。通过插入橡皮塞之针头及所连接的乳胶或塑料管与洗脱液瓶相连接。
3. 平衡
启开出水口螺旋夹，控制流速12～14滴/min。使约2倍床体积的洗脱液流出。并以pH计与电导仪分别测定洗脱液及流出液之pH值与离子强度，两者达到一致时关闭出水口，停止平衡。
4. 加样及洗脱??
启开上口橡皮塞入下口螺旋夹，使柱中液体缓慢滴出，当柱面液体与柱面相切时，立即关闭出水口，以毛细滴管沿柱壁加入样品（体积应<床体积2%，蛋白浓度以<100mg为宜）。松开出水口螺旋夹使面样品缓慢进入柱内， 至与柱面相切时，立即关闭下口，以少量洗脱液洗柱壁2～3次 ；再放开出水口，使洗液进入床柱，随后立即于柱面上加入数毫升洗脱液，紧塞柱上口，使整个洗脱过程成一密闭系统。并控制流速12～14滴/min。
5. 收集
开始洗脱的同时就以试管进行收集。每管收集3～5ml 。共收集10～15管。
6. 测蛋白
以751型紫外分光光度计分别测定每管OD 280nm, 与OD 260nm,按公式计算各管蛋白含量 。并以OD 280nm为纵座标，以试管编号为横座标，绘制洗脱曲线。
7. 合并、浓缩
将洗锐峰的上坡段与下坡段各管收集液分别进行合并，以peg（mw6000）浓缩至所需体积，加入0.02% NaN3防腐，于4℃保存备用。长期保存时应贮于-40℃冰箱。
8. a-50凝胶的再生
在柱上先以2mol/l NaCl洗脱蛋白至流出液的OD 280nm<0.02，再以蒸馏水洗去柱中盐。然后按预处理过程将a-50再处理一遍即达到再生。近期用时泡于洗脱缓冲液中4℃保存；近期不用时，以无水酒精洗2次， 再置50℃温箱烘干，装瓶内保存。
注意事项
（1） 柱的选择：从理论上说，只要柱足够长，就能获得理想的分辨率，但由于层析柱流速同压力梯度有关，柱长增加使流速减慢，峰变宽，分辨率降低。柱的直径增加，使流体流动的不均匀性增加，分辨率明显下降。
（2） 纯化过程必须严格控制缓冲液的pH及离子强度 。样品与a-50凝胶必须用洗脱缓冲液彻底平衡后，才能进行柱层析。
（3） 所装的柱床必须表面平整，无沟流及气泡，否则应重装。
（4） 洗脱过程中应严格控制流速，切勿过快。
（5） 上样的体积要小，浓度不宜过高。
（6） 加样及整个洗脱过程中，严防柱面变干。
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