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免疫组织化学技术介绍

点击： 作者： 来源： 时间： 2007-11-20 　本站论坛

（二）切片
组织得到很好处理后在进行切片之前还应对玻璃片进行处理，由于我们检测抗原是多种多样的，因染色操作程序复杂，时间较长，有些抗原是要进行各种抗原修复处理，如微波、高压、水溶酶等，玻片如果得不到很好的处理，将易造成脱片，为保证免疫组化实验的正常进行，要求在贴片前对载玻片作适当处理，必须在清洗干净的玻片上进行粘合剂的处理以防脱片。
1 Poly-L-Lysine (多聚左旋赖氨酸) 一般采用分子量30000左右的0.5%多聚赖氨酸最好，也可用试剂公司出售的其浓溶液以1：10去离子水稀释。方法是将玻片浸泡其中，倾尽余液，在60℃温箱中烤干备用，此方法的优点是可以用于多种组织化学、免疫组化及分子学检测中的应用，粘贴效果最好，但价格稍贵。
2 明胶硫酸铬钾法将2.5g明胶加热溶于500ml蒸馏水中，完全溶解冷却后加入0.25g硫酸铬钾搅匀充分溶解即可使用。方法是将玻片浸泡其中2 min，取出控尽液体入温箱中烤干备用。此法价格便宜、方法简单，任何实验都可以使用，特别适用于大批量的使用，但应注意，如果液体变蓝或粘稠状停用。
3 APES (3-氨丙基-乙氧基甲硅烷) 此法必须现用现配。将洗净玻片入1:50丙酮稀释的APES中，浸泡20s，取出稍停再入丙酮或蒸馏水中刷去末结合的APES晾干即可。用此方法粘合的玻片应垂直烤片不能平拷，否则组织片中易出现气泡。
切片必须保持切片刀锐利，切片要薄而平整、无皱摺、无刀痕，如有上述问题的切片在进行免疫组化染色都将出现假阳性现象，切片厚度一般为3~4μm，切好的切片在60℃温箱中过夜，注意烤片的温度不宜过高，否则易使组织细胞结构破坏，而产生抗原标记定位弥漫现象。

（三）免疫组化染色方面
S—P免疫组化染色步骤
S—P免疫组化染色试剂盒采用生物素标记的第二抗体与链霉菌抗生物素蛋白连接的过氧化物酶及底物色素混合液来测定细胞和组织中的抗原。染色的主要过程如下：
1．石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS(pH7．4)冲洗三次，每次3分钟(3×3’)。
2．根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复。
3．每张切片加1滴或50ul过氧化酶阻断溶液(试剂A)，以阻断内源性过氧化物酶的活性，室温下孵育10分钟。
4．PBS冲洗3×3’。
5．甩去PBS液，每张切片加1滴或50ul的非免疫性动物血清(试剂B)，室温下孵育10分钟。
6．甩去血清，每张切片加1滴或50ul的第一抗体(用户自选)，室温下孵育60分钟或4℃过夜，建议参阅每种抗体的说明书。
7．PBS冲洗3×5’。
8．甩去PBS液，每张切片加1滴或50ul生物素标记的第二抗体（试剂C），室温下孵育10分钟。
9．PBS冲洗3×3’。
10．甩去PBS液，每张切片加1滴或50ul链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液(试剂D)，室温下孵育10分钟。
11．PBS冲洗3×3’。
12．甩去PBS液，每张切片加2滴或100ul新鲜配制的DAB或AEC溶液，显微镜下观察3—10分钟，阳性显色为棕色或红色。
13．自来水冲洗，苏木素复染，0.1％HCL分化，0.1％氨水或PBS冲洗返蓝。
14．如果用DAB显色，则切片经过梯度酒精脱水干燥，(二甲苯透明)，中性树胶封固；如果用AEC显色，则切片不能经酒精脱水，而直接用水性封片剂封片。

免疫组化染色方法已不是什么很难的问题，操作步骤简单也易掌握，但要染好免疫组化，其中方法的技巧将是每位操作者在实际工作中不断摸索和探讨的事，但最基本的应从以下方面加以注意。

1 去除内源酶及内源性生物素一般我们进行免疫组化标记的都是一些生物体组织，其中自身含有一定量的内源酶和内源性生物素，而免疫组化各种染色大部分是用过氧化物酶来标记抗体的，酶的作用是催化底物，使显色剂显色，而组织中的内源性酶同样也能催化底物，使其显色，这就影响免疫组化的特异性，所以在标记抗体的过氧化酶进人组织切片之前就应设法将组织内的内源性各种酶灭活，以保证免疫组化染色在特异性情况下进行。
1．1 去除内源酶常用的去除内源性酶的方法是3%过氧化氢水溶液。但在含有丰富血细胞的标本中，由于其中含有大量的具有活性的过氧化物酶，能与过氧化氢反应，出现气泡现象，易对组织结构和细胞形态产生一些不良影响，但用3%过氧化氢的方法，能够去除大部分内源性酶，即使有些血细胞在显色后也出现棕黄色反应，但由于其形态结构与组织细胞不同，也易鉴别，而且此方法比较通用易操作，但应注意过氧化氢的浓度不能过高，一般为3%一5%，时间不宜过长，最好室温10min。
1．2 去除内源性生物素在正常组织细胞中也含有生物素，特别是肝、脾、肾、脑，皮肤等组织中，在应用亲和素试剂的染色中，内源性生物素易结合卵白素，形成卵白素一生物素复合物，导致假阳性，所以在采用生物素方法染色前也可以将组织切片进行0.01%卵白素溶液室温处理20min，使其结合位点饱和，以消除内源性生物素的活性。
1．3 灭活碱性磷酸酶最常用的方法是将左旋咪挫(以每毫升加24mg)加入底物液中并保持pH值为7.6~8.2，能除去大部分内源性碱性磷酸酶，对于仍能干扰染色的酸性磷酸酶可用0.05mo1/L酒石酸抑制。

2 抑制非特异性背景着色非特异性着色最常见的情况是抗体吸附到组织切片中高度荷电的胶原和结缔组织成分上，而出现背景着色，为了防止这种现象，最好用特异性抗体来源的同种动物灭活的非免疫血清在特异性抗体之前进行处理，以封闭荷电点，不让一抗与之结合，但这种方法一般实验室很难实现，一般常见实用的血清是2%~10%羊血清或2%牛血清白蛋白在室温下作用10~30min即可，但应注意此种结合是不牢固结合，所以最好不要冲洗，倾去余液直接加一抗，对于多克隆抗体来讲，易产生背景着色，在稀释特异性抗体时可采用含1%非免疫血清的pH7.4的PBS液。

3 缓冲液免疫组化染色标记是对生物体组织抗原进行标记，抗原抗体最适合的pH值为7.2~7.6，最常用的是0.0l mol / LpH7.4磷酸缓冲液(PBS)。简易配法：5000ml蒸馏水中分别加入l g NaH2PO4、15.6gNa2HPO4 、42.5gNaCl。但如果是采用碱性磷酸酶(AP)作为标记物底物的方法时可以用0.02mol/L TBS pH8.2缓冲液比较好。

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