| 免疫组化技术之免疫酶法 | | 点击： 作者： 来源： 时间： 2007-11-12 本站论坛 |
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（2）间接法
间接法是先用未标记的特异性抗体(一抗）与标本中相应抗原反应，再用抗特异性抗的酶标记抗体与结合在抗原上的一抗（即特异性抗体）反应。例如，第一次使用的特异性抗体(一抗）是由家兔产生的，则第二次使用的抗体（二抗）必须是酶标记的抗兔的免疫球蛋白，常用的羊抗兔lgG的酶标记物（即酶标羊抗兔IgG）。然后与直接法相同，与底物反应、显色、将抗原的性质，部位和含量检测出来。
间接法的优点是用一种酶标抗体就可与多种特异性一抗配合而检查多种抗原，而且敏感性也优于直接法。
（3）酶桥法
酶桥法的建立是免疫酶法重大改进的标志。将用化学交联法将酶与抗体分子结合的技术改进为用酶和酶抗体免疫反应而结合的方法，避免了由于化学反应过程中对酶活性和抗体效价的不良影响。其基本原理是用酶免疫动物，制备高效价、特异性强的抗酶抗体，然后用第二抗体作桥，将抗酶抗体和特异性的第一抗体（即连结在组织抗原上的抗体）连接起来，再将酶结合在抗酶抗体上，经过酶催化底物的显色反应后，显示出抗原所在的部位及含量。作为桥的第二抗体（即桥抗）必须对特异性抗体（一抗）和酶抗体都具有特异 性，这样才能将二者相连起来，因此，一抗和酶抗体应由同一种属动物产生。例如，特异性抗体和酶抗体都是兔产生的，再用羊抗兔IgG作为桥抗体就能将两者连接起来。在此 过程中，由于任何抗体均未被酶标记，酶是通过免疫学原理与抗酶抗体结合的，避免了共价连接对酶活性的影响，提高了方法的敏感性，同时也节省了特异性抗体（即一抗）的用量。
酶桥法虽然克服酶标记抗体法的缺点，较好地保护了抗体和酶的活性，但是仍存在不足，其主要表现为①在抗酶抗体的抗血清中，含有低亲和力和高亲和力两类抗体，它们作为抗原与抗体结合，主要依赖于桥抗体对它的亲和力，而与其本身对酶的亲和力无关，故两者均可被连接在桥抗体上，由于低亲和力的抗酶抗体与酶结合较弱，漂洗时易解离，使部分酶丢失，从而降低了方法的敏感性。②抗酶抗体血清中，亦含有非特异性抗体，其抗原性与抗酶抗体相同，所以能与桥抗体结合，但却不能与酶结合，这样影响了组织抗原的显示。为解决这些不足，70年代初，Sternberg在各种标记抗体法和酶桥法的基础上，建立了PAP法，并加以改良，成为应用最为广泛的免疫组织化学技术之一。
（4）PAP法
PAP法是酶桥法等基础之上建立的，其基本原理与酶桥法相似，都是利用桥抗体将 酶连接在第一抗体结合的部位，所不同的是，将酶和抗酶抗体制成复合物（PAP）以代替酶桥法中的抗酶抗体和随后结合的酶，将两个步骤合并为一个步骤，这一重要的改进，不仅仅是简化步骤，而具有更大的优势，因为PAP是由3个过氧化物酶分子和2个抗酶抗体分子结合形成的一个环形分子，排列呈五角形结构，3个角辣根过氧化酶（HRP），另2个角为抗HRP抗体，其分子量为400，000~430，000道尔顿，直径约为20.5nm，这种结构异常稳定，冲洗时酶分子不会脱落，从而大大提高了敏感性，Petrali等报告，PAP法比酶桥法灵敏度高20倍。有人认为是免疫荧光法的100~1000倍。
PAP法应用广泛，其主要优点为：
1) 最大限度地保存了抗体活性。
因为在所有的反应过程中，任何抗体均未被酶标记，避免了标记过程中对抗体活性的损害。
2) 灵敏度高。
由于是多层抗原抗体反应，由于免疫放大作用，使得结合在抗原抗体复合物上的酶分子增多，并且PAP法复合物性质结构稳定，这样与酶底物反应后的呈色反应增强，使微量的或抗原性弱的抗原显示出来，提高了灵敏度。
3) 背景淡。
酶桥法中，酶标记的非特异性抗体可与组织抗原结合，引起背景染色，给结果判断带来了很大的困难。
PAP法中，连接抗体中即使存在着非特异性抗体，因其不是抗IgG的特异性抗体，故不能与抗HRP抗体相结合，也就不能把PAP复合物连接在非特异性抗体上。当然PAP复合物内也可存在一些非HRP特异性抗体，假如这部分抗体能够与桥抗体及组织成分相结合，但因其不是抗HRP抗体，所以不能与HRP结合，也就无酶活性及背景染色。背景越淡，当然越有利于结果的判断。
PAP法的不足之处是PAP的制备较为复杂。
双PAP法又称双桥法（double bridged technique），是PAP法的重要改进，通过两次连接桥抗体和PAP，在抗原抗体复合物上结合了比PAP法更多的酶分子，可提高敏感性达20~50倍。一般认为，双PAP法通过下述途径来提高敏感性，①重复的桥抗体与PAP中的抗HRP抗体的抗原未饱和位置结合，再连接PAP复合物，即在抗原之处，抗体间形成更大的抗原抗体复合物，具有多个酶分子，使免疫染色增强。②重复的桥抗体，与特异性的第一抗体未饱和抗原相结合，使第一抗体上结合较多的桥抗体和PAP复合物，起到放大作用。双PAP法的不足之处是步骤多，需时长，在实际操作中，可能会带来非特异性放大的问题而影响结果的判断。
（5）APAAP法
APAAP——碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase antialkaline phosphatase, APAAP）法是Mason和Moir（1983）等在PAP法的基础上，用AKP替代HRP而建立的一种方法，都属于未标记抗体桥联法。APAAP法与PAP一样，利用桥抗体将AKP连接在第一抗体的结合部位，而AKP和抗AKP抗体被制成复合物（APAAP），通过APAAP复合物中的AKP催化底物显色以显示抗原物质。
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