（四）红血球的致敏
1．致敏抗原剂量的确定 一般而言，在一定的范围内，抗原的浓度与试验的敏感性呈正比，超过这个范围，再增加抗原，敏感性不会再提高，而且过大，有时会引起非特异性凝集。当采用一种新的抗原时，必须经过试验，选择适当的抗原致敏浓度，即把抗原稀释成几个不同的浓度分别致敏红血球。再用这些致敏红血球分别与标准阳性血清进行试验，与标准阳性血清呈最高滴度的阳性反应的最小抗原剂量，即为该抗原的单位计量。致敏时，根据不同的抗原，可采用2～4个单位计量进行致敏。
2．致敏方法 各种抗原的致敏方法大致相同，一般蛋白质的致敏方法如下：
所需浓度的抗原 1 份
pH6.4PBS液 4 份
2.50％的鞣化红血球悬液 1 份
混匀，置37℃水浴30min，离心，沉淀后，以2.5％兔血清
生理盐水洗涤1次，悬浮于1份兔血清
生理盐水中。
3．影响红血球致敏的因素
⑴要有高纯度或高效价的抗原或抗体。
⑵被致敏抗原或抗体的适当剂量和浓度。如抗体一般以μg/ml IgG为宜。抗猪瘟IgG一般用80μg/ml～160μg/ml，抗口蹄疫IgG 20μg/ml~40μg/ml，抗猪水泡病IgG 130μg/ml~160μg/ml，抗猪肺疫IgG 30μg/ml ~40μg/ml，抗猪弓形体20μg/ml~40μg/ml，抗原一般用0.2mg/ml～1mg/ml。
⑶pH：除鸡卵蛋白采用4.6～5.1外，其它通常采用5.6～6.4，高于7.2或低于4.6均可使红血球发生自凝。
⑷致敏温度：一般为37℃，范围是20℃～40℃。
⑸致敏时间：一般采用30min为最适时间，具有良好的特异性和重复性。也有采用60min。时间过长，会造成红血球的形态不整，反应结果紊乱等。
⑹血球浓度：一般为1％，范围为0.5％～1.5％。
（五）操作方法
可采用试管法、凹窝板法和微量法。前者稀释度准确、结果清晰、终点明确。后者具有节约材料、操作方便、结果出现迅速等优点。
试管法的供试材料用兔血清盐水二倍递减稀释，每管0.50ml，各管加致敏血球0.05ml，充分振荡，混匀后置室温，红血球完全沉下（需数小时）或过夜后判定结果。
每次试验需做下列对照：①血清对照：最高浓度的血清＋鞣酸血球；②鞣酸血球对照：兔血清盐水＋鞣酸血球；③致敏血球对照：兔血清盐水＋致敏血球；④标准阳性血清对照：稀释已知滴度的阳性血清，加致敏血球以检验试验的敏感性是否前后一致。
（六）结果判定
＋＋＋＋：管底呈细密的颗粒凝集，边缘不整齐。
＋＋＋ ：全管底呈光滑的均匀片层，边缘折叠。
＋＋ ：全管底呈光滑的均匀片层，如伞状。
＋ ：管底大部分复以光滑片层，边缘稍厚。
± ：较“＋”面积更小，中央有沉积的红血球。
— ：红血球沉积在管底中央，如小圆盘或钮扣状。
以“＋＋”为滴度终点。
五、间接血凝检测多杀性巴氏杆菌荚膜抗原 （一）材料与试剂
1．绵羊红血球
2．标准多杀性巴氏杆菌荚膜菌种A、B、D、E。
3．待测荚膜群的多杀性巴氏杆菌
4．戊二醛（G.R.）
5．pH7.2的PBS液
6．阿氏液（Alserers）
葡萄糖 2.05g
柠檬酸钠（5H
2O） 0.80g
柠檬酸（H
2O） 0.05g
NaCl 0.42g
H
2O 加至 100.00ml
混合过滤，8磅15min灭菌备用 。
（二）操作方法
1．多杀性巴氏杆菌荚膜抗原的制备 在血清裂解血琼脂平板上筛选待测的多杀性巴氏杆菌荧光性典型的菌落（荧光性弱的可通过小白鼠或本动物复壮），接种于血清裂解血琼脂斜面或改良马丁汤琼脂斜面，每株接两管，于37℃培养16h左右，达融合生长后，用2ml
生理盐水（每管1ml）洗下，收集于小试管中，于56℃水浴30min，然后以8 000r／min离心30min，取上清液即可。
2．红血球的醛化 无菌采取绵羊血，以阿氏液保存或以玻璃珠脱纤，用
生理盐水将红血球洗涤3次，以pH 7.2 PBS配制成5％的悬液（以全血量为50％红血球计算），另将戊二醛以pH7.2PBS稀释成2.5％的溶液。
5％红血球 100ml
2.5％戊二醛溶液 20ml
混合后以磁力搅拌器室温搅拌1h，用
生理盐水洗涤4次，再用pH7.2PBS液配制成50％的醛化红血球悬液（即加至原血量的体积），加1／万硫柳汞防腐，分装小瓶，置4℃保存备用。
3．红血球致敏 2ml荚膜抗原加入50％醛化红血球悬液0.20ml，充分混匀，37℃作用2h，中间轻轻振荡数次，离心去上清，再用
生理盐水洗涤一次，最后加入10ml
生理盐水，混匀，即为1％的致敏红血球液。
4．荚膜高免血清的制备和处理 选Cartor A、B、D、E 标准菌株分别接种于马丁琼脂斜面，37℃培养10h～18h，以灭菌
生理盐水洗下，加福尔马林处理，使其达0.3％福尔马林菌液浓度为200亿／ml～300亿／ml的悬液。选一岁左右的健康绵羊作为制备荚膜高免血清用的动物。第一次皮下注射加有氢氧化铝佐剂的死菌抗原2ml，2～3周后开始用不加佐剂的死菌悬液，每周注射2次，剂量为1ml，1ml，2ml，2ml，3ml，3ml，……10ml，最后放血，常规收获血清，即为荚膜定型用高免血清。
取A、B、D、E标准荚膜高免血清 2ml，置56℃灭活30min，加入50％醛化红血球0.4ml，37℃作用2h，离心去红血球即可。
5．反应术式，见表5-2
表5-2间接血凝加样表
各成分加毕后，充分摇匀，置室温中2h～3h观察结果。
（三）结果判定
＋＋＋ ： 凝集的红血球铺得较宽，或卷边或有缺口。
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