4.塑料切片 塑料包埋切片常用包埋剂有甲基丙烯酸盐类(Glycol methacrylate, GMA)及环氧树脂类(Epon 812,618),其优点是可以同时作光镜和电镜检测,能相互对照所查抗原,定位准确。塑料包埋切片可切出比石蜡切片更薄的切片,光镜切片可薄至0.5~2um,故称半薄切片(Semithin section)。GMA保存抗原较好,不与组织产生共聚合,但形态学结构欠佳。环氧树脂如Fpon和Araldite能较好地保存形态学结构,但在聚合过程中易和组织起作用,改变抗原结构。塑料包埋切片由于处理程序繁多,抗原活性易丢失。同时半薄切片进行免疫染色时,抗血清不易穿透树脂,因此,塑料切片主要用于免疫电镜的超微切片前定位。包埋前染色的标本,切片薄切片后不需染色,直接在相差显微镜下观察免疫反应部位呈黑点状,定位后进一步作超薄切片,这样,可以明显提高免疫电镜阳性检出率。
5.超薄切片 电镜标本制作见第七章 ,应用超薄切片机(Ultrotome)进行切片。
6.碳蜡切片 碳蜡(Carbowax),学名聚乙烯二醇(Polyethlene glycol, PEG)为水溶性蜡。根据其分子量不同,碳蜡有多种,如400、800、1000、1500、4000、6000等,用于组织包埋的有1500、4000两种,其熔点分别38℃C和52。C左右,常温下为固体石蜡状,加温熔化呈液体状。
本法的特点是组织固定水洗后,不需脱水透明可直接浸蜡包埋,且切片方法与常规石蜡切片相同。切下的组织片漂浮水面后自然展开,碳虹迅速深化,组织片即可展平,制片过程简单易行。
具体操作简述如下:组织块不宜过大,一般限定在1.5cm×1cm×0.1cm以内。①组织固定后充分水洗去除固定液,用滤纸吸干组织表面水。②将组织浸入碳蜡(1500)内,45℃30min。③再次浸入混合混合碳蜡液(1500和4000等量混合液),52℃30min。④浸入等量混合碳蜡液(或根据气温、湿度变化调整4000和5000混合比例,如气温高湿度大可以4000:1500=3:2混合,反之,则2:3混合)。⑤用等量混合碳蜡或调整混合碳蜡包埋成组织蜡块。⑥切片与石蜡切片相同。在操作过程中,碳蜡组织块应尽量避免与水或冰接触,贮存时应密封干燥冷藏。
本法优点是操作程序减少,时间缩短,组织不经有机溶剂损害、温度低、抗原性保存比石蜡切片好,组织结构清晰。缺点是夏季室温高时切片较困难,连续切片不如石蜡切片顺利;由于碳蜡有强吸湿性,不易长期保存。
7.玻片处理和涂胶 在免疫组化染色过程中由于各种原因常造成标本(细胞制片和组织切片)脱片现象,影响了工作质量和速度。一般采取两种方法即可防止脱片现象出现。
(1)载玻片和盖玻片处理:新载玻片上有油污,必须经过清洁液浸泡12~24h,流水充分漂洗后用蒸馏水清洗5遍以上,浸泡在95%酒精内2h,用绸布擦干或用红外线烤箱烤干均可,贮放于玻片盒内备用。盖玻片很薄,以上处理程序必须缩短,清洁液浸泡只需2h,流水冲洗注意勿损伤玻片等。
(2)载玻片上涂粘附剂:粘附剂种类较多,常用的有以上几种:①树脂胶(Resin glue)又称白色乳胶,为木工用,有进口,国产之分,有人认为进口白色树脂胶较稳定,我们认为国产白乳胶(聚醋酸乙烯乳液J-北京产)质量尚稳定。使用浓度为1%~2%,以蒸馏水稀释即可。②甘油明胶,混匀后涂在载玻片上,切片贴附后置有副醛的干燥器内,加热80℃1h。③甲醛明胶, 混合后即可涂片。④铬明矾明胶, 混合后即可涂片,置37℃温箱烤干。⑤多聚赖氨酸液:多聚赖氨酸0.1g,加蒸馏水10ml,混合后即可涂片。此液不宜多配制。⑥3-Amino propy Eri-ethoxy Silame(APES)。
粘附剂2~5配制法见附录一。
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