¨ PI可嵌入到双链
DNA和
RNA碱基对中并与之结合，但对碱基无特异性选择。
¨ 最大吸收光谱是493nm，最大发射光谱是630nm，呈红色荧光。
2、荧光抗体的保存
¨ 一要防止抗体失活，二要保持荧光素不脱落和不受激发猝灭。
– 一般认为0～4°C可保存1～2年，-20°C可保存3～4年。
– 要小量分装，防止反复冻融。
– 保存前需加防腐剂 (浓度为1:5000～10000的硫柳汞或1:1000～5000叠氮化钠) 。
3、免疫荧光的染色方法
¨ 免疫荧光染色法常用的有
– 直接法
– 间接法
j原理：将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应 (用来检测未知抗原)。
k直接免疫荧光法的操作步骤
¨ 标本的处理：
– 细胞涂片、细胞爬片浸入冷丙酮或4%的多聚甲醛固定10min，然后用0.0lM PBST (含0.l%TritonX-100 pH 7.4) 漂洗5min × 3/次；
– 石蜡切片经脱蜡、梯度酒精脱水后，进行抗原修复，然后用0.01M PBST漂洗5min × 3/次；
¨ 2%BSA或10%BSA37℃湿盒内封闭30min
¨ 抗体染色：
– 在标本片上滴加适当稀释的荧光标记抗体(1:8或1:16稀释)，放在湿盒中，37℃孵育30min；
k直接免疫荧光法的操作步骤(续)
¨ 0.0lmol/L PBS(pH 7.4) 漂洗5min × 3/次，不时震荡(洗去多余游离的荧光素标记的抗体)。
¨ 缓冲甘油封片
– 分析纯无荧光的甘油9份 pH 9.2，0.2M碳酸盐缓冲液1份配制。
¨ 镜检：在荧光显微镜下观察。
¨ 优点：方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。
¨ 缺点：敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。若检测多种抗原需制备多种相应的荧光标记抗体。
m直接免疫荧光法的注意事项
¨ 对荧光标记的抗体的稀释：要保证抗体的蛋白有一定的浓度；
¨ 一般稀释度不应超过1:20，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。
m直接免疫荧光法的注意事项 (续)
¨ 染色温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化；
– 染色时间：从10 min到数小时，一般30 min；
– 染色温度：多采用室温(25℃)，高于37℃可加强染色效果，但对不耐热的抗原(如流行性乙型脑炎病毒)可采用0-2℃的低温，延长染色时间。
– 低温染色过夜较37 ℃ 30 min效果好的多。
m直接免疫荧光法的注意事项 (续)
¨ 试验时需设置下列对照：
– 自发荧光对照(空白对照)：标本加0.01mol/L，pH7.4的PBS代替一抗。
– 阳性对照：用已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。
– 特异性对照(抑制试验)：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体。
¨ 若标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。
m直接免疫荧光法的注意事项 (续)
¨ 一般标本在高压汞灯下照射超过3min，就有荧光减弱现象；
¨ 经荧光染色的标本最好在当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。
(2) 间接法又称为荧光抗-抗体法
j 需要两种抗体参与，即一抗和二抗(荧光素标记)。一抗对标本中的抗原来说起抗体的作用，但对荧光标记的二抗来说又起着抗原作用。
– 可用来检测标本中未知抗原，也可检测血清中未知抗体。
k间接免疫荧光法操作步骤
¨ 标本的处理及非特异染色的封闭同直接法；
¨ 一抗染色：
– 加未标记的特异性抗体(通常1:100稀释，用0.01MpH7.4的PBS稀释)，37℃作用30min或4℃过夜。
¨ 0.01M PBST漂洗5min×3次(震荡漂洗)；
k间接免疫荧光法操作步骤(续)
¨ 加荧光标记的二抗抗体，37℃湿盒避光作用30min。
¨ 0.01M PBST避光漂洗5min×3次(例如包上锡纸，在摇床上漂洗)；
¨ 甘油缓冲液封片
¨ 镜检
¨ 优点：敏感性较高，比直接法高10倍左右；制备一种荧光标记抗体，可应用于多种一抗；
¨ 缺点：是参加反应的因子较多，产生非特异性染色的机会增多。
m间接免疫荧光法的注意事项
¨ 荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长 ，会使荧光减弱。
¨ 每次试验时 ，需设置以下三种对照：
– 阳性对照：阳性血清 荧光标记物
– 阴性对照：阴性血清 荧光标记物
– 荧光标记物对照：PBS 荧光标记物
m间接免疫荧光法的注意事项(续)
¨ 标本片需在操作的各个步骤中，始终保持湿润，避免干燥。
¨ 一抗和二抗应始终保持在标本片上，避免因放置不平使液体流失，从而造成非特异性荧光染色。
(二) 免疫酶酶标法
【原理】
¨ 以酶作为标记物与外加底物作用后产生不溶性色素，沉积于抗原和抗体反应的部位；
¨ 酶降解底物的量与色泽浓度成正比。可反映被测定的抗原或抗体的量。
1、常用的标记酶及其显色底物
¨ 辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)及底物
¨ 碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, AP)及底物
(1) 辣根过氧化物酶(HRP)及底物
¨ HRP是应用最广的一种酶，来源于植物辣根，由无色的酶蛋白和深棕色的铁叶琳结合而成，分子量约40kDa，稳定性好；
¨ 底物为过氧化物和供氢体(DH
2)
– 过氧化物：常用过氧化氢和过氧化氢尿素。
– 供氢体：多用无色的还原型染料，通过反应生成有色的氧化 型染料，最常用的供氢体是DAB。
DAB (二氨基联苯胺)
¨ DAB本身无色，反应后呈棕色，不溶于水，不易褪色，电子密度高，最为常用。
¨ 目前已经有商品化的试剂盒，使用起来非常方便。
(2) 碱性磷酸酶(AP)及底物
¨ AP为磷酸酯的水解酶，可通过两种反应显色：
– 偶氮偶联反应，底物为a-萘酚磷酸盐，经水解后得a-萘酚，与重氮化合物如坚牢蓝(fast blue)或坚牢红(fast red)形成不溶性沉淀，分别呈兰色或红色。
– 靛蓝-四唑反应：底物为溴氯羟吲哚磷酸盐(5-bromo-4-chloro-3-indodyl phosphate,BCIP)，经酶水解并氧化形成靛蓝，而氮蓝四唑(NBT)在此氧化过程中被还原成不溶性紫兰色沉淀。
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