¨ 组织标本
– 石蜡切片
– 冰冻切片
¨ 细胞标本
– 组织印片
–
细胞培养片(细胞爬片)
– 细胞涂片
(一) 石蜡切片
¨ 石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法
– 最大优点是组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；
– 石蜡块还能长期存档，供回顾研究。
¨ 石蜡切片制作过程对组织内抗原显现有一定的影响，但可通过某些措施予以改善，因而它是大多数免疫组化中首选的组织标本制作方法。
1、取材的特殊要求及注意事项
¨ 标本新鲜：一般在2h以内进行，超过2h，组织将有不同程度的自溶，其抗原或变性消失，或严重弥散。
¨ 取材部位：除取病灶或含待检抗原部位外，还应取病灶与正常交界处，即所取组织切片中同时应有抗原阳性和阴性区，以形成自身对照。
– 细胞坏死后，不仅抗原弥散或消失，而且常引起非特异着色，干扰观察，因此取材时应尽可能避开坏死区。
1、取材的特殊要求及注意事项(续)
¨ 避免挤压：取材时组织受挤压可使边缘部细胞形态改变并加深非特异着色，因而取材时应使用锋利的刀刃；
– 镊取组织动作要轻；
– 经窥镜直接钳取的组织往往有过度挤压，观察结果时应有所考虑。
2、固定及常用的固定液
¨ 取材后的组织需立刻投于固定剂中
– 固定使组织和细胞的蛋白质凝固，终止内源性或外源性酶反应，防止组织自溶或异溶，以保持原有结构和形态；
– 对免疫组化而言更有原位保存抗原的作用，避免抗原失活或弥散。
¨ 常用固定液：固定剂品种很多，但大多属于醛类和醇类。其固定原理不同，各有优缺点。
– 醛类（常用甲醛、戊二醛和多聚甲醛）
– 醇类（常用乙醇）
– 其它 （丙酮）
(1) 醛类
¨ 甲醛(福尔马林)应用最广
– 原理：形成分子间的交联，影响蛋白构型而使之固定。
– 优点：形态结构保存好，且穿透性强，组织收缩少。
– 缺点：
• 甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液pH降低，影响染色；
• 醛基与抗原蛋白的氨基交联形成羧甲基，使抗原决定簇的三维构象出现空间障碍；
• 分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露。可造成假阴性的染色结果。
– 注意事项：
• 缩短固定时间，降低固定温度(4°C)，为此组织块不宜过厚。
• 改用中性缓冲福尔马林，以pH值7.2～7.4 0.01mol/L的磷酸盐缓冲液配制成10％甲醛固定液，减少固定液pH的变化。
• 固定后充分水洗以减少分子间交联。
• 切片在作免疫组化染色前，先经预处理使抗原再现(抗原修复)。
¨ 戊二醛：
– 穿透性强，微细结构保存好，但对抗原有一定影响，常与其他固定剂联合用作免疫电镜固定液。
¨ 多聚甲醛(常用4%)：
– 可用于免疫电镜；也可用于免疫荧光染色。
• 主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗原，例如各类淋巴细胸分化决定簇(CD)、主要组织相容性抗原等。
(2) 醇类
¨ 最常用的醇类固定剂是乙醇。
– 其固定作用：使细胞内蛋白、糖类发生沉淀。
– 优点：穿透性强、抗原性保存好。
– 缺点：
• 脱水性强，易引起组织收缩、变硬，影响切片质量，因而乙醇固定时间不宜过长(2h内)。
• 乙醇使蛋白变性的作用轻，固定后可再溶解；染色过程中，温育时间长，抗原可流失而减弱反应强度。
(3) 其它固定剂
¨ 丙酮：
– 对抗原性的保存好，但脱水性更强，较少 用于组织标本，但细胞爬片常用丙酮固定。
3、抗原修复——原因
¨ 常规的石蜡切片标本均用甲醛固定，结果使得：
– 抗原性物质形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇；
– 蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。
¨ 要求：在染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。
3、抗原修复——方法
¨ 化学方法
¨ 加热方法
– 水浴加热法
– 微波照射法
– 高压加热法
– 酸水解法
(1) 化学方法
¨ 主要是通过一些酶的作用，使抗原决定簇暴露。常用的酶有：胰蛋白酶、胃蛋白酶等。
– 胰蛋白酶：一般使用浓度为0.05％～0.1％，消化时间为37℃，10～40min，主要用于细胞内抗原的显示；
– 胃蛋白酶：一般使用浓度为0.1%～0.4％，消化时间为37℃、30～180min，主要用于细胞间质抗原的显示。
• 例如：Laminin、CollagenIV
(2) 水浴加热法
¨ 将玻片放入装有抗原修复液的容器中，加热至沸腾，持续10～15分钟。
– 优点：操作简单、经济，适用于所有的实验室，
– 缺点：对封闭牢固的抗原决定簇暴露不理想。
(3) 微波照射法
¨ 将玻片放入装有抗原修复液的容器中，置微波炉加热至95℃以上，持续l0～15分钟，冷却后，按免疫组化染色步骤进行。
¨ 此方法由于微波场内极性分子、离子高速运动，撞击交联的网链，使抗原异常的构想恢复正常，且因分子运动产热、效率高、时间短，对抗原再现效果好。
(4) 高压加热法暴露抗原
¨ 将玻片浸入抗原修复液内，置高压锅中高压2～3min，可取得极好的效果。
¨ 由于高压下受热均匀，特别使用于大批量标本的染色。
(1) 酸水解法
¨ 酸水解可使交联断裂、暴露抗原。
¨ 将玻片浸入1mol/L HCl 溶液中，室温作用20min(温度升高，作用时间缩短)。
¨ 此法能增强特异性染色，降低背景，但需注意水解过度将破坏抗原性及形态结构。
加热法的注意事项
¨ 达到规定的温度(92～95°C以上)；
¨ 维持一定的时间；
¨ 避免切片干涸 (抗原可能完全丢失)；
¨ 加热后必须经过室温自然冷却20～30分钟，使未折叠的蛋白分子链恢复天然构型；
¨ 修复液：
– 最常用的是pH6.0的0.01mol/L的枸橼酸盐缓冲液；
– 最新研究表明碱性修复液更有效，推荐使用1mM的EDTA缓冲液(pH8.0)。
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