二、信号转导中第二信使含量的测定

　　二、信号转导中第二信使含量的测定

　　信号转导过程中，第二信使（second messenger）含量的高低同信号传递密切相关。目前测定的第二信使主要包括细胞内Ca²⁺（[Ca²⁺]i）、二酰基（DAG）、三磷酸（IP3）以及环酸（cAMP）等。

　　1.[Ca²⁺]i的测定　细胞内Ca²⁺的测定方法有原子光谱法、离子微电极测定法、放射示踪法及标记示踪法等。目前常用标记示踪法，即用荧光探针标记靶细胞。常用的荧光探针有quin-2/Am、Fura-2/Am及Indo-1等。Fura-2/Am和Indo-1较为敏感。

　　2.IP3的测定　采用³H-TdR标记的肌醇标记靶细胞后，用不同的刺激剂刺激细胞，分离磷脂酰肌醇混合物，通过阴离子交换层析柱（Serva公司Dowex1*8）分离洗脱，收集IP3洗脱峰后进行液闪测定。此外，还可以使用Amersham公司生产的D-myo-IP3[³H]分析系统直接测定粗提物中的IP3含量，此方法简易、敏感。

　　3.DAG的测定　首先提取含DAG的样品，然后采用Amersham公司生产的DAG分析系统进行测定。此系统测定的原理是用DAG激酶催化底物DAG，使之发生磷酸化，外源加入³²γ-ATP，最后将反应产物进行分离后测定放射性含量，根据标准品计算出样品中DAG的含量。

　　4.cAMP的测定　可选择不同的方法：（1）cAMP[³H]分析系统，其优点是放射性半衰期长，可用于大量样品的分析；（2）cAMP[¹²⁵I]分析系统，用于小量样品的分析；（3）cAMp ILISA测定方法，此方法简便、敏感。