SPA的纯化

1．DEAE－Sephadex A－25离子交换层析法

⑴ 用0.1mol/L NH₄HCO₃缓冲液平衡DEAE－Sephadex A－25柱。

⑵ 加样后，用0.1mol/L NH₄HCO₃缓冲液洗脱12h~14h。

⑶ 改用0.4mol/L NH₄HCO₃缓冲液洗脱，流速0.15ml~0.2ml/min，收集流出液，测OD₂₇₅nm。

⑷ 测SPA活性(以对流免疫电泳)，能与人及猪正常血清产生沉淀线的各管合并。

⑸ 浓缩或冻干保存。

2．Sphadex G100凝胶过柱法

装柱、加样，以0.05mol/L pH7.4 PBS洗脱，收集洗脱液，如上法测定活性和蛋白含量。

3．亲和层析法

(1) 猪IgG的制备：取正常猪血清，硫酸铵提取 球蛋白，再过DEAE－纤维素－32柱，制得纯化的IgG，以0.1mol/L NaHCO₃液平衡，配成4mg~5mg/ml溶液。

(2) 偶联：将固体溴化氰1.2g溶于20ml蒸馏水中，倾入容积为15ml的Sepharose－4B中，搅拌，同时滴加2mol/L NaOH使pH维持在11.0，反应8min，用500ml预冷的0.1mol/L NaHCO₃在2号砂芯漏斗上洗脱已活化的Sepharose－4B(在90Sec内洗脱完毕)，迅速加入IgG液15ml，于4℃缓慢搅拌过夜，次日以PBS充分洗涤，至洗出液OD₂₈₀nm＜0.02为止。加入30ml 1.0mol/L乙醇胺洗柱，以封闭残余活性基团，再以PBS洗至中性为止。

(3) PBS亲和层析：将粗制SPA溶于PBS液中，加入IgG－Sepharose－4B柱，流速0.2ml/min，以PBS洗至OD₂₈₀nm＜0.02为止，换用0.1mol/L pH2.3甘氨酸－盐酸缓冲液洗脱，流速0.2ml/min，收集洗脱液，即为纯化的SPA，对流电泳检查SPA活性，收集，浓缩，保存。