SPA提取IgG

原理

将SPA偶联至Sepharose－4B上后，利用亲和层析来提取人和某些动物的IgG，这样可以省去制备第二抗体。该法特别适用于单克隆抗体的研究。该法提取IgG与利用IgG纯化SPA原理是一致的。

材料与试剂

1．Sepharose－4B琼脂糖

2．SPA

3．溴化氰

4．0.10Mol/L NaHCO₃液

5．pH3.2盐酸－甘氨酸液

6．生理盐水

7．待提取的IgG样品

8．层析柱(2cm×10cm)

9．磁力搅拌器

10．751分光光度计

操作方法

1．Sepharose－SPA的制备 在50ml三角烧瓶中加入蒸馏水20ml，加入固体溴化氰1.4g，加盖后温和振荡，使之溶解。倒入已盛有琼脂糖珠(4B)的烧杯中，立即搅拌，并滴加2mol/L NaOH溶液，边加边搅拌，使pH维持在11。反应6min后，倒入布氏漏斗，迅速以预冷的0.1mol/L NaHCO₃溶液500ml抽滤洗涤已活化的琼脂糖珠。洗涤时间不超过90Sec，立即将此琼脂糖珠加入预先以0.1mol/L NaHCO₃平衡的SPA液10ml中(10mg/ml)，于4℃搅拌16h～20h，此即为Sepharose－SPA的吸附剂。

2．将Sepharose－SPA低速离心5min，以生理盐水洗涤2－3次，除去未偶联上的SPA，然后装入2cm×10cm层析柱中，用生理盐水200ml洗至洗液OD_280nm＜0.02。

3．亲和层析 将欲提取的IgG样品用生理盐水做1:5稀释后，加入Sepharose－SPA层析柱，以生理盐水洗脱，流速20ml/h。IgG被柱上的SPA吸附住，其它蛋白质随洗脱液流出。以生理盐水洗至洗脱液的OD_280nm＜0.02为止。

4．解吸附 以pH2.0盐水－甘氨酸缓冲液进行洗脱，将洗脱下来的蛋白液迅速以1mol/L的NaHCO₃液中和至pH 7.0，此即为提纯的IgG。

5．将收集的IgG液测定其蛋白含量、活性和纯度后，浓缩、分装、低温保存备用。

6．Sepharose－4B－SPA柱复生 采用7mol/L尿素洗柱后，再用生理盐水洗涤，最后用PBS液平衡后，可重复使用。

结果判定

1．IgG的收集量。

2．IgG的纯度鉴定 可采用圆盘电泳或免疫电泳进行鉴定。

3．IgG的活性鉴定 可采用抗该IgG的ELISA试验，以鉴定IgG的活性。