原理
B淋巴细胞表面具有补体C3受体，红细胞可与相应的抗体（溶血素）结合形成抗原抗体复合物（EA），以红细胞作为指示细胞，通过补体传统途径活化补体，而产生活化的C3，然后与活化的C3结合形成花环，以供计数B淋巴细胞。
材料与试剂
1．鸡红细胞悬液的制备 由于绵羊红细胞易与T淋巴细胞形成E—玫瑰花环，易造成混淆，所以一般在检测B淋巴细胞时，采用鸡红细胞。从鸡翼下静脉采血，用肝素抗凝，以Hank’s洗涤2次备用。
2．抗鸡红细胞抗体的制备 选2kg～3kg的健康家兔，以Hank’s液洗过的压积红细胞进行免疫，每日背部皮下注射1次，共注5次，注射量为0.5 ml、1.0 ml、1.5 ml、2.0 ml、2.5ml。第六次改用静脉注射50％压积红细胞悬液1ml，一日一次，连注3天。末次注射后7天试血，测定红细胞的凝集效价，以出现“ ”的最高抗血清稀释度判定为血凝效价。效价达1：2 000以上者为合格。应用时采用凝集价的1／2（亚凝集价）作为抗血清的稀释度（即1：4 000）。
溶血素的效价测定
试验组
对照组
管号
1
2
3
4
5
6
7
8
溶血素稀释倍数
10
102
103
2×103
3×103
4×103
5×103
1 ％红细胞量（ml）
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
溶血素量（ml）
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.9％盐水（ml）
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
混匀，37℃感作1h
结果判定
-
-
-
-
3．补体 当日采集豚鼠混合血清，用Hank’s液稀释成1︰100，置4℃保存备用。
4．无Ca2 、Mg2 pH7.2的Hank’s液
5．姬姆萨染液
6．1％戊二醛溶液
操作方法
1．分离淋巴细胞，制成约2.5×106个／ml悬液。
2．EAC悬液的制备 取4％鸡红细胞2ml于试管中，加入1︰4 000的鸡溶血素2ml，混匀，置37℃水浴15min，取出后离心，用Hank’s液洗涤2次，再用Hank’s液恢复至4％红细胞2ml，加入等量的1︰100稀释补体，混匀，再放置37℃水浴15min取出，用Hank’s液洗涤2次，配成4％EAC细胞悬液。
3．取淋巴细胞悬液0.2ml，加入4％EAC细胞悬液0.2ml，混匀，室温或20℃作用30min。1 000r/min离心5min，吸弃过多的上清液，放入4℃2h～4h。
4．取出后，将沉淀轻轻摇起，加1％戊二醛0.1ml，混匀后置4℃固定30min。
5．以悬液制片，自然干燥，滴加姬姆萨液染2min，加自来水继续放置15min，冲洗，将玻片置95％酒精缸脱色15sec~30sec（以脱成浅紫蓝色为度），再置盐酸液缸（按1％HCl 1份与自来水2份）脱色（呈淡兰略带红色为度）10sec左右，取出冲洗，干后镜检。
结果判定
凡一个淋巴细胞结合3个以上鸡红细胞即为EAC花环形成阳性细胞。共计数200个淋巴细胞，计算花环形成率。
注意事项
1．加入淋巴细胞与鸡红细胞的比例一般以1︰40为宜（1︰30～1︰50），淋巴细胞过少，花环形成率明显减少。
2．淋巴细胞、红细胞、补体均应新鲜，否则花环形成率明显下降。
3．据认为小鼠补体比豚鼠补体更为好，小鼠血清中胶固素活化因子（KAF）含量较多，可使大部分C3裂解而不易引起溶血。
